A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos e células de Schwann nervosas. Este protocolo permite o isolamento de cada um desses tipos de células para experimentos in vitro. O isolamento e o estabelecimento de culturas celulares primárias individuais de um único doador permitem comparações robustas e experimentos de cocultura, ao mesmo tempo em que mitigam os efeitos da variação genética.
Com este protocolo, a análise das células individuais e suas interações permite a análise do papel das células schwann na homeostase da pele e na fisiopatologia. Essas populações de células distintas podem ser usadas para estudar células schwann, fibroblastos ou queratinócitos individualmente ou em combinação em fisiologia normal da pele, cicatrização de feridas ou em estados doentes da pele. Jagadeeshaprasad M G, um pós-doutorando no meu laboratório estará me ajudando a demonstrar o procedimento.
Após a aquisição do prepúcio neonatal seguindo o padrão de procedimentos assistenciais, coloque o prepúcio excisado em um tubo de micro centrífuga contendo de oito a dez mililitros de meio basal DMEM gelado, e transporte imediatamente a prepúcio para o laboratório de cultura celular para isolamento de células. Enxágüe o prepúcio duas vezes com 20 a 25 mililitros de Salina Tamponada de Fosfato de Dulbecco ou DPBS, contendo antibióticos e antimícticos. Em seguida, mergulhe a pele lavada em 25 a 30 mililitros de meio basal DMEM gelado em um prato de cultura de tecido de 10 centímetros.
Após 15 minutos corte o prepúcio aberto usando um bisturi para expor a dermis e o tecido adiposo subcutâneo. Use fórceps, uma lâmina de bisturi e uma tesoura para remover e descartar o tecido adiposo subcutâneo. Em seguida, corte o prepúcio limpo em três a cinco peças menores e incuba as peças de pele em 16 a 20 mililitros de Dispace um meio DMEM em um tubo cônico estéril.
Durante os primeiros 30 minutos de incubação com Dispace, misture intermitentemente as peças da pele no tubo cônico por inversão. Em seguida, coloque o tubo cônico a quatro graus Celsius por 16 a 18 horas. No dia seguinte, remova os pedaços da pele e coloque-os em um prato de cultura estéril seco e desenrole cada pedaço de pele para que a camada externa de epiderme esteja tocando o prato de cultura.
Começando na borda do tecido, retire a epiderme da derme usando dois conjuntos de fórceps. Adicione os fragmentos separados de epiderme a cinco mililitros de HBS em um prato de cultura de 10 centímetros para incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, colete a solução HBS em um tubo cônico de 50 mililitros e adicione cinco mililitros de tampão de neutralização de trypsin ou T e B no tubo cônico.
Coloque o tubo de lado. Aos fragmentos epidérmicos no prato de cultura adicione três mililitros de solução trypsin para incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação agitar suavemente os fragmentos epidérmicos com fórceps até que a solução de queratinócitos de trypsin se torne turva.
Em seguida, adicione a solução de queratinócito de trypsin ao tubo HBS T e B. Depois de dissolver fragmentos epidérmicos não digdigestos com a solução EDTA trypsin, adicione dois mililitros de FBS ao tubo HBS T e B contendo solução EDTA de trippsina, e centrifugar os dois cerca de 870 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aspire o supernascer e resuspenha a pelota celular em três mililitros de meio de crescimento completo queratinato, seguido de filtragem da suspensão celular com um filtro estéril de 100 micrômetros em um tubo cônico estéril de 50 mililitros.
Uma vez quantificado o número celular e a viabilidade celular, semear as células nas placas de cultura para colocar em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Depois de dois dias aspirar as células não aderidas, e atualizar a mídia de cultura celular a cada dois dias até que os queratinócitos atinjam 50 a 80% de confluência para experiências de passagem ou a jusante. Precoat T25 frascos com poli-l-lysine ou PLL, usando cinco mililitros de DPBS e coloque os frascos pré-revestidos a 37 graus Celsius por três horas.
Depois lave a matriz de revestimento PLL duas vezes com DPBS. Depois de lavar os pedaços isolados da derme com cinco mililitros de meio basal DMEM, pique a derme em pequenos pedaços com tesouras. Digerir a dermis picada com cinco mililitros de colagemnase a 37 graus Celsius por duas horas e meia, com titulação suave usando uma ponta de pipeta a cada 30 minutos até que a dermis dissocia completamente.
Uma vez digerido, filtre a suspensão celular com um coador de células de 70 micrômetros, seguido de diluição da suspensão celular filtrada com cinco mililitros de meio DMEM completo para parar a atividade enzimática da colagemnase. Em seguida, a centrifugação da suspensão celular a 870 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente e resuspensa a cédula de células em dois mililitros de MMEM meio completo para dividir as células. Depois de repetir o processo de centrificação como descrito, aspire o supernatante para usar a pelota celular para isolar as células ou fibroblastos schwann.
Para isolar as células Schwan, resuspenque a pelota celular em cinco mililitros de médio médio fresco DMEM completo e quantifique o número celular e a viabilidade antes de semear cinco mililitros das células resuspended em frascos T25 pré-codificados a uma densidade de 4,0 vezes 10 às três células por mililitro. Incubar o frasco a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 16 horas confirme a adesão celular por microscopia na ampliação de 10X.
Em seguida, remova as células de não adesão e lave o frasco três vezes com cinco mililitros de DPBS. Em seguida, incubar as células com cinco mililitros de 10 arabinoside de citosina micromolar em um meio completo de DMEM. Após 24 horas aspirar a citosina arabinoside contendo meio antes de enxaguar o frasco como demonstrado anteriormente.
Rechee o frasco de cultura com cinco mililitros de células Schwann completam o meio de cultura para incubar 48 horas, enquanto refresca o meio a cada dois dias até que as células Schwann atinjam 80% de confluência. Para isolar os fibroblastos, resuspensar a pelota coletada em cinco mililitros de fibroblastos completos. Para cultivar as células em frascos de cultura T25 não codificados por 24 horas, como demonstrado para as células Schwann.
Depois de aspirar as células de não adesão e lavar o frasco, incubar as células com cinco mililitros de fibroblastos frescos completos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Como as células primárias isoladas foram cultivadas em suas respectivas mídias de cultura celular, os queratinócitos primários atingiram 85% de confluência no sétimo dia e apresentaram morfologia celular característica com forma de paralelepípedos. As células Schwann atingiram 95% de confluência no quinto dia e pareciam bipolares ou tripolares em forma.
As culturas dos fibroblastos atingiram 95% de confluência até o quarto dia e a maioria das células exibiu uma morfologia em forma de fuso. A coloração da imunofluorescência confirmou a expressão proteica específica do tipo celular nas culturas celulares. Os queratinócitos deram positivo para a proteína K10 e K14.
As imagens mescladas de imunofluorescência de queratina e coloração nuclear da DAPI indicaram 97,8% de pureza das culturas celulares. Da mesma forma, as células Schwann foram positivas para S100 e P75 NTR e tiveram uma pureza de 95,2% na cultura. Os fibroblastos expressaram positivamente a vimentina, mas não expressaram o músculo alfa liso Actin, um marcador de miofibroblast.
A pureza da cultura foi em torno de 97,2% Para melhorar a evidência de Shanse, o prato poli-l-lysine pré-revestido pode ser usado. E para mitigar ainda mais a contaminação fibrosa, o arabinoside citosino e o agente antimíctico foram adicionados após as células terem sido adicionadas por um curto período de tempo. Este é um procedimento experimental simples e barato para estabelecer as três células primárias, como células shwann, queratinócitos e fibroblastos, a partir de uma única pele de fore humana.
Este protocolo é ideal para experimentos in vitro envolvendo comunicação celular ou crosstalk entre tipos de células.
