피부에는 각질세포, 섬유아세포, 신경 슈완 세포를 포함한 여러 세포 유형이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 시험관내 실험을 위해 이들 세포 유형 각각의 단리를 허용한다. 단일 기증자로부터 개별 일차 세포 배양물을 분리하고 확립하면 강력한 비교 및 공동 배양 실험이 가능하며 유전 적 변이의 영향을 완화 할 수 있습니다.
이 프로토콜을 통해 개별 세포와 그 상호 작용의 분석은 피부 항상성 및 병리 생리학에서 Schwann 세포의 역할을 분석 할 수있게합니다. 이러한 별개의 세포 집단은 슈완 세포, 섬유아세포, 또는 각질세포를 정상 피부 생리학, 상처 치유 또는 피부 병든 상태에서 개별적으로 또는 조합하여 연구하는데 사용될 수 있다. Jagadeeshaprasad M G, 내 실험실의 박사 후 학자 인 Jagadeeshaprasad M G는 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다.
표준 관리 절차에 따라 신생아 포피를 획득 한 후, 적출 된 포피를 8 ~ 10 밀리리터의 얼음 차가운 DMEM 기본 배지가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 즉시 포피를 세포 배양 실험실로 운반하여 세포를 분리하십시오. 항생제와 항균제가 들어있는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 20 ~ 25 밀리리터로 포피를 두 번 헹구십시오. 이어서, 세척된 피부를 25 내지 30 밀리리터의 얼음 차가운 DMEM 기초 배지에 10 센티미터 조직 배양 접시에 담그십시오.
15분 후 포피를 얇게 썰어 메스를 이용하여 열어 진피와 피하 지방조직을 노출시킨다. 포셉, 메스 블레이드 및 가위를 사용하여 피하 지방 조직을 제거하고 버립니다. 그런 다음 깨끗한 포피를 세 개 내지 다섯 개의 작은 조각으로 자르고 멸균 원뿔형 튜브에서 16 내지 20 밀리리터의 Dispace 하나의 DMEM 배지에서 피부 조각을 인큐베이션한다.
Dispace로 인큐베이션한 첫 30분 동안 간헐적으로 원뿔형 튜브의 피부 조각을 역전시켜 혼합한다. 그런 다음 원뿔형 튜브를 섭씨 4도에서 16 ~ 18 시간 동안 놓습니다. 다음날 피부 조각을 제거하고 건조한 멸균 배양 접시에 올려 놓고 피부의 각 조각을 풀어 바깥 표피층이 배양 접시에 닿도록 합니다.
조직의 가장자리에서 시작하여 두 세트의 포셉을 사용하여 표피를 진피에서 멀리 떼어냅니다. 분리된 표피 단편을 10센티미터 배양 접시에 HBS 다섯 밀리리터에 첨가하여 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 HBS 용액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 5 밀리리터의 트립신 중화 버퍼 또는 T 및 B를 원뿔형 튜브에 첨가하십시오.
튜브를 따로 두십시오. 배양 접시의 표피 절편에 트립신 용액 3 밀리리터를 첨가하여 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양하십시오. 인큐베이션에 이어 트립신 각질세포 용액이 혼탁해질 때까지 포셉으로 표피 단편을 부드럽게 교반시킨다.
다음으로 트립신 각질세포 용액을 HBS T 및 B 튜브에 첨가한다. 소화되지 않은 표피 절편을 트립신 EDTA 용액으로 용해시킨 후, 트립신 EDTA 용액을 함유하는 HBS T 및 B 튜브에 FBS 두 밀리리터를 첨가하고, 섭씨 네 도에서 5분 동안 약 870배 G를 원심분리한다. 이어서, 상청액을 흡인하고, 세포 펠릿을 3밀리리터의 케라티노사이트 완전 성장 배지에 재현탁시키고, 이어서 세포 현탁액을 멸균된 100 마이크로미터 필터로 멸균된 50 밀리리터 원뿔형 튜브 내로 여과하였다.
일단 세포 수 및 세포 생존율이 정량화되면, 세포를 배양 플레이트에 시드하여 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소로 배치한다. 이틀 후 부착되지 않은 세포를 흡인하고, 각질형성세포가 계대 또는 하류 실험을 위해 50 내지 80%의 합류율에 도달할 때까지 격일로 세포 배양 배지를 새로 고친다. 5 밀리리터의 DPBS를 사용하여 폴리-l-라이신 또는 PLL로 T25 플라스크를 프리코트하고 예비코팅된 플라스크를 섭씨 37도에서 3시간 동안 놓습니다.
나중에 PLL 코팅 매트릭스를 DPBS로 두 번 세척한다. 진피의 분리 된 조각을 다섯 밀리리터의 DMEM 기본 배지로 세척 한 후 진피를 가위로 작은 조각으로 다듬습니다. 다진 진피를 섭씨 37도에서 콜라게나제 5밀리리터로 두 시간 반 동안 소화하고, 진피가 완전히 해리될 때까지 30분마다 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 적정합니다.
일단 소화되면, 세포 현탁액을 70 마이크로미터 세포 스트레이너로 여과하고, 이어서 여과된 세포 현탁액을 5밀리리터의 완전한 DMEM 배지로 희석하여 콜라게나제의 효소 활성을 정지시킨다. 다음으로 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 870배 G에서 원심분리하고, 세포 투표용지를 두 밀리리터의 DMEM 완전 배지에 재현탁시켜 세포를 분할한다. 기재된 바와 같이 농축 과정을 반복한 후, 상청액을 흡인하여 세포 펠릿을 사용하여 슈완 세포 또는 섬유아세포를 분리한다.
슈완 세포를 단리하기 위해, 세포 펠릿을 5밀리리터의 신선한 DMEM 완전 배지에 재현탁시키고, 미리 코딩된 T25 플라스크에 재현탁된 세포의 5밀리리터를 밀리리터당 3개의 세포에 4.0배 10배의 밀도로 시딩하기 전에 세포 수 및 생존율을 정량화한다. 플라스크를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 인큐베이션하십시오. 16시간 후 10X 배율에서 현미경으로 세포 부착을 확인하였다.
그런 다음 부착되지 않은 세포를 제거하고 플라스크 세 번을 다섯 밀리리터의 DPBS로 세척하십시오. 다음으로 세포를 DMEM 완전 배지에서 10 마이크로몰 시토신 아라비노사이드의 다섯 밀리리터로 인큐베이션한다. 24시간 후 시토신 아라비노사이드 함유 배지를 흡인하여 이전에 입증된 바와 같이 플라스크를 헹구었다.
배양 플라스크를 다섯 밀리리터의 슈완 세포 완전 배지로 리필하여 48시간 배양하고, 슈완 세포가 80%컨플루언시에 도달할 때까지 격일로 배지를 리프레시한다. 섬유아세포를 분리하기 위해, 수집된 펠렛을 섬유아세포 완전 배지의 다섯 밀리리터에 재현탁시킨다. 세포를 코딩되지 않은 T25 배양 플라스크에서 24시간 동안 슈완 세포에 대해 입증된 바와 같이 배양하였다.
부착되지 않은 세포를 흡인하고 플라스크를 세척한 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 5밀리리터의 신선한 섬유아세포 완전 배지로 48시간 동안 인큐베이션한다. 분리된 일차 세포를 각각의 세포 배양 배지에서 배양함에 따라, 일차 각질세포는 일곱째 날까지 85%컨플루언시에 도달하였고, 조약돌 모양의 특징적인 세포 형태를 나타내었다. 슈완 세포는 5일째까지 95%의 합류율에 도달했고, 양극성 또는 삼극성 모양으로 나타났다.
섬유아세포 배양물은 넷째 날까지 95%의 합류율에 도달하였고, 대부분의 세포는 스핀들 형상 형태를 나타내었다. 면역형광염색을 통해 세포 배양물에서 세포형 특이적 단백질 발현을 확인하였다. 각질세포는 K10 및 K14 단백질에 대해 양성이었다.
케라틴 면역형광 및 DAPI 핵 염색의 병합된 이미지는 세포 배양물의 97.8% 순도를 나타냈다. 유사하게, 슈완 세포는 S100 및 P75 NTR에 대해 양성이었고, 배양물에서 95.2%의 순도를 가졌다. 섬유아세포는 비멘틴을 긍정적으로 발현하였으나, 근섬유아세포 마커인 알파 평활근 액틴을 발현하지는 않았다.
배양물의 순도는 약 97.2 %로 Shanse의 증거를 향상시키기 위해 사전 코팅 된 폴리 l- 라이신 접시를 사용할 수 있습니다. 섬유질 오염을 더욱 완화시키기 위해, 시토신 아라비노사이드 및 항균제를 세포가 짧은 시간 동안 첨가한 후에 첨가하였다. 이것은 단일 인간 포피로부터 송곳 세포, 각질 세포 및 섬유 아세포와 같은 세 가지 기본 세포를 확립하기위한 간단한 저렴한 실험 절차입니다.
이 프로토콜은 세포 세포 통신 또는 세포 유형 간의 누화를 포함하는 시험관내 실험에 이상적입니다.
