Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, hierarchische Gefäßnetzwerke innerhalb einer vollständig entwickelten und implantierbaren Klappe zu generieren, was den Weg für neue Studien zum Verhalten von Blutgefäßen unter Integration in vivo ebnete. Diese Technik kombinierte die Vielseitigkeit von zwei 3D-Drucktechnologien, um Gefäße auf Mikro- und Mesoskala herzustellen und zusammenzubauen, die mittels Mikrochirurgie direkt mit Wirtsgefäßen anastomosiert werden können. Vollständig entwickelte vaskularisierte Lappen können zur Behandlung großer Gewebedefekte sowie zur Untersuchung von Gewebeentwicklungen und -integrationen eingesetzt werden.
Die vorgeschlagenen Methoden können erweitert werden, um den Einbau gewebespezifischer Zellen zu untersuchen und die Verwendung verschiedener Bioink- und Trägermaterialien zu bewerten. Beginnen Sie mit dem Füllen der BVOH-Form mit 30 Mikrolitern der Polymerlösung. Zentrifugieren Sie die Form bei 100 mal g für 2 Minuten und füllen Sie die Form mit weiteren 20 Mikrolitern der Polymerlösung, um eine vollständige Abfüllung zu gewährleisten.
Frieren Sie die gefüllten Formen bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 30 Minuten ein, um sicherzustellen, dass die gesamte Polymerlösung gefriert. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den Schimmelpilzen, indem Sie sie über Nacht lyophilisieren. Um das Opferformmaterial zu entfernen, geben Sie die Formen nach dem Gefriertrocknungsprozess unter sanftem Rühren in ein 5-Liter-Deionwasserbad.
Ersetzen Sie das Wasser im Bad, wenn es trüb wird. Wenn sich alle BVOH aufgelöst haben, trocknen Sie die Gerüste an der Luft und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einer Vakuumkammer. Übertragen Sie etwa 4 Milliliter des vorbereiteten, verdichteten Trägermaterials mit einer Verdrängerpipette in jedes Bohrloch einer 12-Well-Platte.
Klopfen Sie auf die Bohrlochplatte auf eine harte Oberfläche, um das Stützmaterial zu zwingen, sich gleichmäßig im Bohrloch zu verteilen. Bereiten Sie eine Suspension vor, die 2 Millionen HAMEC-ZsGreen und 6 Millionen Stammzellen der Zahnpulpa in 10 Millilitern Endothelzellmedium enthält. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 200 mal g für 4 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten, dann saugen Sie das überstehende Medium ab und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 Milliliter rhCollMA-Biotinte, um eine Biotinte mit einer Gesamtzellkonzentration von 8 Millionen Zellen pro 1 Milliliter Biotinte zu erhalten.
Bringen Sie eine Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,22 Millimetern an eine 3-Milliliter-Bernsteindruckpatrone und legen Sie die Patrone in ein konisches 50-Milliliter-Rohr. Übertragen Sie 1 Milliliter der Zell-Bioink-Mischung auf die Druckpatrone, indem Sie sie von oben mit einer Verdrängungspipette füllen, um Blasen zu reduzieren. Setzen Sie die Druckpatrone in das entsprechende Werkzeug am Bioprinter ein.
Skizzieren Sie ein 2D-Muster eines 4-Millimeter-Quadrats, das einen kreisförmigen Kanal mit einem Durchmesser von 2 Millimetern in der Mitte enthält. Extrudieren Sie die Skizze um 4 Millimeter, um einen 4-Millimeter-Würfel mit einem zentralen Kanal zu erhalten. Exportieren Sie dieses Objekt als STL-Datei.
Importieren Sie eine 12-Well-Plate-STL-Vorlage in die Registerkarte Solid Modeling in der Bioprinter-Slicing-Software und platzieren Sie sie im dafür vorgesehenen Bereich des virtuellen Druckbetts. Importieren Sie die STL-Datei der Würfelform in die Registerkarte Volumenmodellierung in der Bioprinter-Slicing-Software. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Externen Datenschnitt verwenden, gefolgt von Datenschnitt konfigurieren im Abschnitt Objekteigenschaft.
Wählen Sie im Popup-Fenster ein geradliniges Muster für das Füllmuster aus und geben Sie 30% in die Fülldichte ein, und klicken Sie auf Akzeptieren. Klicken Sie auf den Würfel und bewegen Sie ihn mit der Maus, um eine Kopie der Würfelform in jeden gewünschten virtuellen Brunnen zu legen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Material hinzufügen auf der Registerkarte Materialien der Bioprinter-Schneidesoftware, um neue Materialeinstellungen für rhCollMA bioink zu erstellen.
Wählen Sie die Materialeinstellungen für den Druck. Für Druck Typ 2 psi und für Geschwindigkeit Typ 20 Millimeter pro Sekunde in den entsprechenden Boxen. Weisen Sie die Werte für Linienbreite und Linienhöhe 0,24 Millimeter und den Beschleunigungswert 400 Millimeter pro Quadratsekunde zu.
Klicken Sie auf der Registerkarte Volumenmodellierung auf das Cubeobjekt und dann auf das rhCollMA-Material aus dem Materialabschnitt, um es der Würfelform zuzuweisen. Klicken Sie auf der Registerkarte Bioassembly auf die Schaltfläche Druckauftrag senden, um den Druckauftrag an den Bioprinter zu senden. Laden Sie die mit der Zellbiotinte beladene Druckpatrone in das 3-Milliliter-Umgebungs-Pneumatik-Dosierwerkzeug des 3D-Extrusions-basierten Bioprinters.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Kühlen unter der Registerkarte Heizung oder Kühlung steuern auf dem Bildschirm der Bioprinter-Schnittstelle, um die Druckbetttemperatur auf 4 Grad Celsius einzustellen. Beladen Sie die Platte mit dem Stützbad auf das Druckerbett. Klicken Sie auf der Registerkarte Drucken auf dem Bildschirm der Bioprinter-Benutzeroberfläche auf den Druckauftrag und dann auf Start, gefolgt von GO, um den Druckauftrag zu starten.
Belichten Sie die Wellplatte nach dem Drucken 305 Sekunden lang einer 405-Nanometer-Lichtquelle mit einer Intensität von 3 Milliwatt pro Quadratzentimeter, um die Vernetzung der rhCollMA-Biotinte einzuleiten. Nach der Vernetzung die Bohrlochplatte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für mindestens 20 Minuten inkubieren, bis das gesamte Stützbad schmilzt. Saugen Sie das verflüssigte Stützbad vorsichtig ab und ersetzen Sie es durch das Endothelzellmedium.
Inkubieren Sie die Konstrukte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Unmittelbar nach der Entfernung des Stützmaterials des biogedruckten mikrovaskulären Netzwerks legen Sie ein mit Fibronektin beschichtetes PLLA:PLGA-Gefäßgerüst neben die biogedruckte Struktur. Setzen Sie das Gefäßgerüst in den Hauptkanal der biogedruckten Struktur ein.
Inkubieren Sie die zusammengebauten Konstrukte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Tage. Bereiten Sie eine Zellsuspension von tdTomato-exprimierenden menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Fett in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter vor. Legen Sie einen 20-Mikroliter-Tröpfchen dieser Zellsuspension auf eine hydrophobe Oberfläche.
Legen Sie die Gefäßgerüste vorsichtig auf das Tröpfchen, so dass das Lumen des Gerüsts an einem Ende mit dem Zelltröpfchen in Kontakt kommt. Saugen Sie das Tröpfchen vom gegenüberliegenden Ende des Gerüsts ab und füllen Sie sein Lumen mit der Zellsuspension. Legen Sie das sitzende Gerüst in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es für 60 Minuten in einen Rotator in einem befeuchteten Inkubator.
Übertragen Sie schließlich das Gerüst in eine 12-Well-Platte und fügen Sie 2 Milliliter Endothelzellmedium hinzu. Die Seitenansicht einer repräsentativen technischen Klappe, die vier Tage nach der Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts aufgenommen wurde, ist hier zu sehen. Die biobedruckte Mikrovaskulatur ist grün dargestellt, während die Endothelauskleidung rot dargestellt ist.
Das repräsentative Bild zeigt die Anastomosen zwischen dem biogedruckten Gefäßsystem und der Endothelauskleidung. Die Immunfärbung für das Aktin, die Kerne und die Endothelzellen der glatten Muskulatur nach sieben Tagen Inkubation wird hier gezeigt. Das repräsentative Bild zeigt abgeschlossene Anastomosen der technischen Klappe mit der Oberschenkelarterie einer Ratte vor der Klemmentfernung und nach der Klemmentfernung.
Diese Technik kann verwendet werden, um die Reifung und Integration von 3D-gedruckten Gefäßen in vivo zu untersuchen und die Perfusion des Implantats in der Hintergliedmaße zu überwachen, um das Potenzial und die Sicherheit für seine Verwendung zur Behandlung von Gewebedefekten zu ermitteln.
