Il nostro protocollo consente ai ricercatori di generare reti di vasi gerarchici all'interno di un lembo completamente ingegnerizzato e impiantabile, che ha aperto la strada a nuovi studi sul comportamento dei vasi sanguigni nell'integrazione in vivo. Questa tecnica ha combinato la versatilità di due tecnologie di stampa 3D per creare e assemblare vasi sulla micro e mesoscala che possono essere direttamente anastomosi con i vasi ospiti utilizzando la microchirurgia. I lembi vascolarizzati completamente ingegnerizzati possono essere utilizzati per trattare difetti tissutali di grandi dimensioni e per fornire una piattaforma per lo studio degli sviluppi e dell'integrazione dei tessuti.
I metodi proposti possono essere estesi per studiare l'incorporazione di cellule tessuto-specifiche, nonché per valutare l'uso di diversi bioink e materiali di supporto. Inizia riempiendo lo stampo BVOH con 30 microlitri della soluzione polimerica. Centrifugare lo stampo a 100 volte g per 2 minuti e rabboccare lo stampo con ulteriori 20 microlitri della soluzione polimerica per garantire il riempimento completo.
Congelare gli stampi riempiti a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti per garantire che tutta la soluzione polimerica si congeli. Rimuovere il solvente dagli stampi liofilizzandoli durante la notte. Per rimuovere il materiale dello stampo sacrificale, trasferire gli stampi dopo il processo di liofilizzazione in un bagno d'acqua deionizzato da 5 litri sotto delicata agitazione.
Sostituisci l'acqua nella vasca da bagno quando diventa torbida. Quando tutto il BVOH si dissolve, asciugare all'aria gli scaffold e conservarli in una camera a vuoto fino all'uso. Trasferire circa 4 millilitri del materiale di supporto compattato preparato in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti utilizzando una pipetta a spostamento positivo.
Toccare la piastra del pozzo su una superficie dura per forzare il materiale di supporto a diffondersi uniformemente nel pozzo. Preparare una sospensione contenente 2 milioni di HAMEC-ZsGreen e 6 milioni di cellule staminali della polpa dentale in 10 millilitri di mezzo cellulare endoteliale. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte g per 4 minuti per ottenere un pellet cellulare, quindi aspirare il mezzo surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 millilitro di bioink rhCollMA per ottenere un bioink con una concentrazione cellulare totale di 8 milioni di cellule per 1 millilitro di bioink.
Montare un ago da 0,22 millimetri di diametro interno su una cartuccia di stampa ambra da 3 millilitri e posizionare la cartuccia in un tubo conico da 50 millilitri. Trasferire 1 millilitro della miscela cellule-bioink alla cartuccia di stampa riempiendola dall'alto utilizzando una pipetta a spostamento positivo per ridurre le bolle. Installare la cartuccia di stampa nello strumento appropriato presso la bioprinter.
Tracciate un modello 2D di un quadrato di 4 millimetri contenente un canale circolare di 2 millimetri di diametro al centro. Estrudete lo sketch di 4 millimetri per ottenere un cubo di 4 millimetri con un canale centrale. Esportare questo oggetto come file STL.
Importare un modello STL a 12 pozzetti nella scheda di modellazione solida del software di affettatura bioprinter e posizionarlo nell'area designata del piano di stampa virtuale. Importare il file STL della forma del cubo nella scheda di modellazione solida nel software di slicing bioprinter. Fare clic sulla casella di controllo Usa filtro dei dati esterno, quindi configurare il filtro dei dati nella sezione delle proprietà dell'oggetto.
Nella finestra popup, scegliete un motivo rettilineo per il modello di riempimento e digitate 30% nella densità di riempimento, fate clic su Accetta (Accept). Fare clic sul cubo e spostarlo utilizzando il mouse per posizionare una copia della forma del cubo in ogni pozzo virtuale desiderato. Fare clic sul pulsante Aggiungi materiale nella scheda materiali del software di affettatura bioprinter per creare nuove impostazioni del materiale per rhCollMA bioink.
Scegliere le impostazioni del materiale per la stampa. Per la pressione, digitare 2 psi e per la velocità digitare 20 millimetri al secondo nelle caselle corrispondenti. Assegnare i valori di larghezza e altezza della linea a 0,24 millimetri e il valore di accelerazione a 400 millimetri per secondo quadrato.
Nella scheda Modellazione solida, fare clic sull'oggetto cubo e quindi fare clic sul materiale rhCollMA dalla sezione materiale per assegnarlo alla forma del cubo. Nella scheda Bioassemblaggio, fare clic sul pulsante Invia processo di stampa per inviare il processo di stampa alla bioprinter. Caricare la cartuccia di stampa caricata con il bioink cellulare nello strumento di erogazione pneumatica ambientale da 3 millilitri della bioprinter basata sull'estrusione 3D.
Fare clic sul pulsante Freddo nella scheda Controllo riscaldamento o raffreddamento nella schermata dell'interfaccia bioprinter per impostare la temperatura del letto di stampa a 4 gradi Celsius. Caricare la piastra con il bagno di supporto sul letto della stampante. Nella scheda Stampa nella schermata dell'interfaccia bioprinter, fare clic sul processo di stampa, quindi fare clic su Start, seguito da GO per iniziare il processo di stampa.
Dopo la stampa, esporre la piastra del pozzo a una sorgente luminosa a 405 nanometri con un'intensità di 3 milliwatt per centimetro quadrato per 30 secondi per avviare la reticolazione del bioink rhCollMA. Dopo la reticolazione, incubare la piastra del pozzo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per almeno 20 minuti fino a quando tutto il bagno di supporto si scioglie. Aspirare delicatamente il bagno di supporto liquefatto e sostituirlo con il mezzo cellulare endoteliale.
Incubare i costrutti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Immediatamente dopo la rimozione del materiale di supporto della rete microvascolare biostampata, posizionare un'impalcatura vascolare PLLA:PLGA rivestita di fibronectina accanto alla struttura biostampata. Inserire l'impalcatura vascolare nel canale principale della struttura bioprinted.
Incubare i costrutti assemblati a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due giorni. Preparare una sospensione cellulare di cellule endoteliali microvascolari adipose umane che esprimono tdTomato-express ad una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro. Posizionare una goccia da 20 microlitro di questa sospensione cellulare su una superficie idrofoba.
Posizionare delicatamente le impalcature vascolari sopra la goccia in modo tale che il lume dell'impalcatura su un'estremità entri in contatto con la goccia cellulare. Aspirare la goccia dall'estremità opposta dell'impalcatura riempiendo il suo lume con la sospensione cellulare. Posizionare l'impalcatura seduta in un tubo di microcentrazione e metterla in un rotatore all'interno di un incubatore umidificato per 60 minuti.
Infine, trasferire l'impalcatura in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere 2 millilitri di mezzo cellulare endoteliale. La vista laterale di un lembo ingegnerizzato rappresentativo ripreso quattro giorni dopo il rivestimento endoteliale dell'impalcatura vascolare è mostrata qui. La microvascolarizzazione biostampata è mostrata in verde, mentre il rivestimento endoteliale è mostrato in rosso.
L'immagine rappresentativa mostra le anastomosi tra la vascolarizzazione biostampata e il rivestimento endoteliale. L'immunocolorazione per l'actina della muscolatura liscia, i nuclei e le cellule endoteliali dopo sette giorni di incubazione è mostrata qui. L'immagine rappresentativa mostra le anastomosi completate del lembo ingegnerizzato con l'arteria femorale di un ratto prima della rimozione del morsetto e dopo la rimozione del morsetto.
Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la maturazione e l'integrazione della vascolarizzazione stampata in 3D in vivo e monitorare la perfusione dell'impianto nell'arto posteriore per stabilire il potenziale e la sicurezza per il suo uso per il trattamento dei difetti tissutali.
