Protokolümüz, araştırmacıların tamamen tasarlanmış ve implante edilebilir bir flep içinde hiyerarşik damar ağları oluşturmalarına olanak tanır ve bu da in vivo entegrasyon altında kan damarı davranışı üzerine yeni çalışmaların yolunu açmıştır. Bu teknik, mikrocerrahi kullanılarak konakçı damarlarla doğrudan anastomoz edilebilen mikro ve mezoölçekte damarlar oluşturmak ve birleştirmek için iki 3D baskı teknolojisinin çok yönlülüğünü birleştirdi. Tamamen tasarlanmış vaskülarize flepler, büyük doku kusurlarını tedavi etmek ve doku gelişmelerini ve entegrasyonunu incelemek için bir platform sağlamak için kullanılabilir.
Önerilen yöntemler, dokuya özgü hücrelerin dahil edilmesini incelemek ve farklı biyomürekkep ve destek malzemelerinin kullanımını değerlendirmek için genişletilebilir. BVOH kalıbını 30 mikrolitre polimer çözeltisi ile doldurarak başlayın. Kalıbı 2 dakika boyunca 100 kez g'de santrifüj edin ve tam doldurmayı sağlamak için kalıbı 20 mikrolitre polimer çözeltisi ile doldurun.
Tüm polimer çözeltisinin donmasını sağlamak için doldurulmuş kalıpları eksi 80 santigrat derecede en az 30 dakika dondurun. Çözücüyü gece boyunca liyofilize ederek kalıplardan çıkarın. Kurban kalıp malzemesini çıkarmak için, dondurarak kurutma işleminden sonra kalıpları hafifçe karıştırarak 5 litrelik deiyonize su banyosuna aktarın.
Bulutlu olduğunda banyodaki suyu değiştirin. Tüm BVOH çözündüğünde, iskeleleri havayla kurutun ve kullanıma kadar bir vakum odasında saklayın. Hazırlanmış, sıkıştırılmış destek malzemesinin yaklaşık 4 mililitresini, pozitif yer değiştirmeli bir pipet kullanarak 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.
Destek malzemesini kuyuya eşit şekilde yayılmaya zorlamak için kuyu plakasına sert bir yüzeye dokunun. 10 mililitre endotel hücre ortamında 2 milyon HAMEC-ZsGreen ve 6 milyon diş pulpası kök hücresi içeren bir süspansiyon hazırlayın. Bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj edin, daha sonra süpernatant ortamı aspire edin ve 1 mililitre biyomürekkep başına toplam 8 milyon hücre konsantrasyonuna sahip bir biyomürekkep elde etmek için hücre peletini 1 mililitre rhCollMA biyomürekkep içinde yeniden askıya alın.
3 mililitrelik sarı yazıcı kartuşuna 0,22 milimetrelik bir iç çaplı iğne takın ve kartuşu 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Kabarcıkları azaltmak için pozitif yer değiştirmeli pipet kullanarak üstten doldurarak 1 mililitre hücre-biyomürekkep karışımını yazıcı kartuşuna aktarın. Yazıcı kartuşunu biyoyazıcıdaki uygun araca takın.
Merkezinde 2 milimetre çapında dairesel bir kanal içeren 4 milimetrelik bir karenin 2B desenini çizin. Merkezi kanallı 4 milimetrelik bir küp elde etmek için çizimi 4 milimetre ekstrüzyon yapın. Bu nesneyi STL dosyası olarak dışa aktarın.
12 delikli bir STL şablonunu biyoyazıcı dilimleme yazılımındaki katı modelleme sekmesine aktarın ve sanal baskı yatağının belirlenen alanına yerleştirin. Küp şeklinin STL dosyasını biyoyazıcı dilimleme yazılımındaki katı modelleme sekmesine aktarın. Harici dilimleyici kullan onay kutusuna ve ardından nesne özelliği bölümünün altındaki dilimleyiciyi yapılandır'a tıklayın.
Açılır pencerede, dolgu deseni için doğrusal bir desen seçin ve dolgu yoğunluğuna %30 yazın, kabul et'i tıklayın. Küpe tıklayın ve istenen her sanal kuyuya küp şeklinin bir kopyasını yerleştirmek için fareyi kullanarak hareket ettirin. rhCollMA bioink için yeni malzeme ayarları oluşturmak üzere bioprinter dilimleme yazılımının malzemeler sekmesindeki malzeme ekle düğmesine tıklayın.
Yazdırma için malzeme ayarlarını seçin. Basınç için, tip 2 psi ve hız için ilgili kutularda saniyede 20 milimetre yazın. Çizgi genişliği ve çizgi yüksekliği değerlerini 0,24 milimetreye, ivme değerini ise saniyede 400 milimetreye atayın.
Katı modelleme sekmesinde, küp nesnesine tıklayın ve ardından küp şekline atamak için malzeme bölümünden rhCollMA malzemesine tıklayın. Biyomontaj sekmesinde, yazdırma işini biyoyazıcıya göndermek için Yazdırma İşi Gönder düğmesini tıklatın. Hücresel biyomürekkeple yüklü baskı kartuşunu, 3D ekstrüzyon tabanlı biyoyazıcının 3 mililitrelik ortam pnömatik dağıtım aracına yükleyin.
Baskı yatağı sıcaklığını 4 santigrat dereceye ayarlamak için biyoyazıcı arabirim ekranındaki Isıtma veya Soğutmayı Kontrol Et sekmesinin altındaki Soğut düğmesine tıklayın. Plakayı yazıcı yatağındaki destek banyosuyla yükleyin. Biyoyazıcı arabirimi ekranındaki Yazdır sekmesinde, yazdırma işini tıklatın, ardından Başlat'ı ve ardından yazdırma işini başlatmak için GİT'i tıklatın.
Baskıdan sonra, rhCollMA biyomürekkebinin çapraz bağlanmasını başlatmak için kuyu plakasını 30 saniye boyunca santimetre kare başına 3 miliwatt yoğunluğa sahip 405 nanometrelik bir ışık kaynağına maruz bırakın. Çapraz bağlamadan sonra, kuyu plakasını 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte tüm destek banyosu eriyene kadar en az 20 dakika inkübe edin. Sıvılaştırılmış destek banyosunu nazikçe aspire edin ve endotel hücre ortamı ile değiştirin.
Yapıları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Biyobaskılı mikrovasküler ağın destek malzemesinin çıkarılmasından hemen sonra, biyobaskılı yapının yanına fibronektin kaplı bir PLLA: PLGA vasküler iskele yerleştirin. Vasküler iskelesi, biyobaskılı yapının ana kanalına yerleştirin.
Toplanan yapıları iki gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. TdDomates-eksprese eden insan yağ mikrovasküler endotel hücrelerinin bir hücre süspansiyonunu mililitre başına 10 milyon hücre konsantrasyonunda hazırlayın. Bu hücre süspansiyonunun 20 mikrolitrelik bir damlacığını hidrofobik bir yüzeye yerleştirin.
Vasküler iskeleleri damlacığın üzerine yavaşça yerleştirin, böylece bir ucundaki iskelenin lümeni hücre damlacığı ile temas eder. Damlacığı, lümenini hücre süspansiyonu ile dolduran iskelenin karşı ucundan aspire edin. Oturan iskeleyi bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörün içindeki bir rotatöre koyun.
Son olarak, iskeleyi 12 delikli bir plakaya aktarın ve 2 mililitre endotel hücre ortamı ekleyin. Vasküler iskelenin endotel astarından dört gün sonra görüntülenen temsili mühendislik flebinin yan görünümü burada gösterilmiştir. Biyobaskılı mikrovaskülatür yeşil, endotel astarı ise kırmızı renkle gösterilir.
Temsili görüntü, biyobaskılı vaskülatür ile endotel astarı arasındaki anastomozları göstermektedir. Yedi günlük inkübasyondan sonra düz kas aktin, çekirdek ve endotel hücreleri için immün boyama burada gösterilmiştir. Temsili görüntü, kelepçenin çıkarılmasından önce ve kelepçenin çıkarılmasından sonra bir sıçanın femoral arteri ile mühendislik flebinin tamamlanmış anastomozlarını görüntüler.
Bu teknik, 3D baskılı vaskülatürün in vivo olgunlaşmasını ve entegrasyonunu incelemek ve doku kusurlarını tedavi etmek için kullanımının potansiyelini ve güvenliğini belirlemek için implantın arka ekstremitedeki perfüzyonunu izlemek için kullanılabilir.
