網膜研究の課題の1つは、網膜ニューロン、グリア細胞、血管細胞などの異なる細胞間のクロストークを研究することです。特に、網膜ニューロンの単離と培養は困難です。私たちは、網膜外植片の培養がこの制限を克服し、血管系に依存しない生化学的パラメータの下で、異なる網膜細胞間のクロストークを研究することを可能にする独自のex vivoシステムを提供できると考えています。
また、網膜外植片は、血管および神経損傷を特徴とする糖尿病性網膜症などのさまざまな網膜血管および神経変性疾患における新しい薬理学的介入を研究するための著名なスクリーニングツールです。私たちの研究室では、長年にわたって微小血管網膜機能障害を促進する病態生理学的変化を研究してきました。in vivoモデルとin vitroモデルの両方を含む多種多様なモデルを利用することで、ラボ内の多くの技術を最適化することができました。
ここでは、2週間培養で保存することができる野生型成体マウス由来の網膜外植片の詳細なプロトコールについて述べる。動物を一定の温度と光制御された環境下に保管してください。すべての動物の健康、十分な食物、水を調べます。
動物に生鮮食品ときれいな水を提供するようにしてください。汚れたケージは毎日、または動物の健康のために必要な場合は交換してください。12週齢以上の雄の黒人6匹のマウスを使用する。
二酸化炭素の過剰摂取によるホームケージ内の動物を安楽死させます。手順が完了したら、心停止や呼吸停止を確認したり、動物の固定および拡張した瞳孔を観察するなど、適切な方法で動物の死亡を確認します。頸部脱臼などの安楽死の二次的な方法による死亡確認に従ってください。
地球が突き出るまで湾曲した鉗子を使用して軌道に圧力をかけます。目の後部にある鉗子をそっと閉じ、連続した動きで持ち上げます。1ミリリットルの氷冷HBSSを含む1.5ミリリットルのチューブに眼球を浸します。
眼球を完全な培地を含む1.5または2ミリリットルのチューブに移します。これで解剖の準備が整いました。この図は、網膜外植片を作成するためにマウス眼球を解剖するために示される連続したステップを示す。
眼球を開くために辺縁に沿って円周方向の切開が行われます。角膜は、辺縁切開に沿って解剖することによって除去される。次に、レンズと硝子体が取り外され、空のアイカップが残ります。
視神経乳頭の領域を微細鉗子で保持することで、眼の外被膜の剥離が穏やかに行われる。神経網膜を傷つけず、網膜を完全に無傷にするために、外皮の除去中に大きな注意を払う。次に、網膜は細かく切断されます。
これは、対照群と実験群が同じ動物に由来する実験を行うことを可能にするため、大きな利点になります。ただし、網膜を細かく切断すると、網膜の取り扱いがより困難になります。そこで、網膜培養の適切な配向を確保するために、これらの小さな網膜片を処理する技術を開発しました。
解剖シザーブレードを網膜片のすぐ下で開いた状態で行きます。開いたハサミ刃の先端で網膜片をゆっくりと持ち上げ、培養プレートにそっと移します。外植片は、神経網膜側を上に向けて300マイクロリットルの網膜外植片培地を含むマルチウェルプレートの細胞培養インサートに別々に移されます。
網膜外植片培養は、加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で維持されます。網膜表面が上を向いていることを確認してください。網膜片がひっくり返ったり折りたたまれたりしている場合は、正しい向きにそっと調整してみてください。
神経網膜を上に向けて網膜外植片を正しい方向に配置しないと、培養中の網膜細胞の適切な増殖が失敗します。ここでは、培養液中で2週間染色した網膜外植片を免疫蛍光染色することができます。外植片を固定し、網膜ニューロンはNeuN、グリア細胞はGFAP、血管はレクチンで染色した。
染色は、よく発達した網膜細胞および網膜血管を示した。ここでは、グリア細胞についてはGFAP、血管についてはレクチンで固定および染色された網膜外植片の免疫蛍光染色を見ることができます。画像は、網膜細胞と網膜血管の両方の欠陥染色と未発達を示しています。
これは、網膜外植片が折り畳まれており、培養プレート上で正しく配向していなかったためです。網膜を上に向けて外植片を適切に方向付けるように細心の注意を払う必要があります。対照群が治療群と同じ単一の動物に由来することは、異なる実験条件のより信頼性の高い比較を有することを大きな利点にする。
網膜インプラントは、糖尿病性網膜症や変性網膜疾患など、さまざまな網膜疾患の治療標的の可能性を調査するための適切なプラットフォームを提供できます。
