Uno de los desafíos en la investigación de la retina es estudiar la diafonía entre diferentes células, como las neuronas de la retina, las células gliales y las células vasculares. En particular, el aislamiento y el cultivo de las neuronas de la retina es un desafío. Creemos que el explante retiniano cultivado puede superar esta limitación y ofrecer un sistema ex vivo único que nos permita estudiar la diafonía entre diferentes células de la retina, bajo parámetros bioquímicos bien controlados e independientes del sistema vascular.
Además, un explante de retina es una herramienta de cribado destacada para estudiar nuevas intervenciones farmacológicas en diversas enfermedades retinovasculares y neurodegenerativas, como la retinopatía diabética, que se caracteriza por lesiones vasculares y neuronales. Nuestro laboratorio ha estado estudiando los cambios fisiopatológicos, promoviendo la disfunción microvascular de la retina durante años. La utilización de una amplia variedad de modelos, incluidos los modelos in vivo e in vitro, nos permitió optimizar muchas técnicas dentro de nuestro laboratorio.
Aquí, describimos un protocolo detallado para los explantes de retina derivados de un ratón adulto de tipo salvaje que se puede mantener en cultivo durante dos semanas. Mantenga a los animales alojados bajo temperatura constante y ambiente con luz controlada. Inspeccione la salud, la alimentación adecuada y el agua de cada animal.
Asegúrese de proporcionar a los animales alimentos frescos y agua limpia. Cambie las jaulas sucias diariamente o según sea necesario para la salud de los animales. Use ratones machos negros 6 de más de 12 semanas de edad.
Eutanasia de los animales en su jaula doméstica por inhalación de sobredosis de dióxido de carbono. Después de completar el procedimiento, confirme la muerte del animal mediante un método apropiado, como confirmar un paro cardíaco y respiratorio u observar las pupilas fijas y dilatadas del animal. Siga la confirmación de la muerte mediante un método secundario de eutanasia, como la luxación cervical.
Aplique presión sobre la órbita usando pinzas curvas hasta que el globo sobresalga. Cierre suavemente los fórceps en la porción posterior del ojo y levántelos en un movimiento continuo. Sumerja el globo ocular en un tubo de 1,5 mililitros que contenga un HBSS helado de un mililitro.
Transfiera el globo ocular a un tubo de 1,5 o dos mililitros que contenga medios completos. Ahora está listo para la disección. Este diagrama ilustra los pasos consecutivos que se mostrarán para diseccionar el globo ocular del ratón para crear el explante de retina.
La incisión circunferencial se hace a lo largo del limbo para abrir el globo ocular. La córnea se extrae mediante disección a lo largo de la incisión limbal. Luego se retiran el cristalino y el vítreo, dejando un ocular vacío.
Al sostener la región de la cabeza del nervio óptico con los fórceps finos, se despega suavemente la capa externa del ojo. Gran atención durante la extracción de la capa externa para no lesionar la retina neural y tener la retina totalmente intacta. Luego, la retina se cortará en trozos más pequeños.
Esto será una gran ventaja, porque te permitirá tener un experimento donde tu grupo de control y grupos experimentales se derivan del mismo animal. Sin embargo, cortar la retina en trozos pequeños hará que su manejo sea más difícil. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para el manejo de estas pequeñas piezas retinianas para garantizar la orientación adecuada del cultivo de retina.
Vaya con la hoja de tijera de disección abierta justo debajo de la pieza retiniana. Eleve lentamente la pieza retiniana con la punta de una hoja de tijera abierta y transfiérala suavemente a la placa de cultivo. Los explantes se transferirán por separado a inserciones de cultivo celular en placas de múltiples pocillos, cada una de las cuales contiene 300 microlitros de medios de explante retiniano con el lado de la retina neural hacia arriba.
Los cultivos de explantes de retina se mantendrán en incubadoras humidificadas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Asegúrese de que la superficie de la retina esté orientada hacia arriba. Si la pieza retiniana está volteada o doblada, intente ajustarla suavemente a la orientación correcta.
Si no se coloca el explante de retina en la orientación correcta con la retina neural hacia arriba, se producirá el fracaso del crecimiento adecuado de las células de la retina en cultivo. Aquí, podemos ver la inmunofluorescencia que tiñe los explantes retinianos teñidos en cultivo durante dos semanas. Los explantes se fijaron y se tiñeron con NeuN para las neuronas de la retina, GFAP para las células gliales y lectina para los vasos sanguíneos.
La tinción mostró células retinianas y vasos retinianos bien desarrollados. Aquí, podemos ver tinción de inmunofluorescencia de explantes retinianos fijados y teñidos con GFAP para células gliales y lectina para vasos sanguíneos. Las imágenes muestran tinciones defectuosas y subdesarrollo tanto de las células de la retina como de los vasos retinianos.
Esto se debe a que el explante retiniano estaba plegado y no estaba orientado correctamente sobre la placa de cultivo. Se debe tener mucho cuidado para la correcta orientación del explante con la retina hacia arriba. Que el grupo de control se derive del mismo animal que el grupo tratado hace que sea de gran ventaja tener una comparación más confiable de diferentes condiciones experimentales.
Los implantes de retina pueden proporcionar una plataforma decente para investigar posibles objetivos terapéuticos para una amplia variedad de enfermedades de la retina, como la retinopatía diabética y las enfermedades degenerativas de la retina.
