Una delle sfide nella ricerca retinica è studiare la diafonia tra diverse cellule, come i neuroni della retina, le cellule gliali e le cellule vascolari. In particolare, l'isolamento e la coltura dei neuroni retinici è impegnativo. Crediamo che l'espianto retinico in coltura possa superare questa limitazione e offrire un sistema ex vivo unico che ci permetta di studiare la diafonia tra diverse cellule retiniche, sotto parametri biochimici ben controllati e indipendenti dal sistema vascolare.
Inoltre, un espianto di retina è uno strumento di screening importante per studiare nuovi interventi farmacologici in varie malattie retinovesculari e neurodegenerative, come la retinopatia diabetica, che è caratterizzata da lesioni vascolari e neuronali. Il nostro laboratorio studia da anni i cambiamenti fisiopatologici, favorendo la disfunzione microvascolare della retina. L'utilizzo di un'ampia varietà di modelli, inclusi modelli in vivo e in vitro, ci ha permesso di ottimizzare molte tecniche all'interno del nostro laboratorio.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per gli espianti retinici derivati da un topo adulto wild-type che può essere tenuto in coltura per due settimane. Mantenere gli animali alloggiati a temperatura costante e in un ambiente controllato dalla luce. Ispezionare ogni animale per la salute, cibo adeguato e acqua.
Assicurati di fornire agli animali cibo fresco e acqua pulita. Cambiare le gabbie sporche su base giornaliera o secondo necessità per la salute degli animali. Usa topi neri maschi 6 di età superiore alle 12 settimane.
Eutanasia gli animali nella loro gabbia domestica per inalazione di overdose di anidride carbonica. Dopo aver completato la procedura, confermare la morte dell'animale con un metodo appropriato, come confermare l'arresto cardiaco e respiratorio o osservare le pupille fisse e dilatate dell'animale. Seguire la conferma della morte con un metodo secondario di eutanasia come la lussazione cervicale.
Applicare pressione sull'orbita usando una pinza curva fino a quando il globo sporge. Chiudere delicatamente la pinza nella porzione posteriore dell'occhio ed elevare in un movimento continuo. Immergere il bulbo oculare in un tubo da 1,5 millilitri contenente un HBSS ghiacciato da un millilitro.
Trasferire il bulbo oculare in un tubo da 1,5 o due millilitri contenente un supporto completo. Ora è pronto per la dissezione. Questo diagramma illustra i passaggi consecutivi che verranno mostrati per sezionare il bulbo oculare del topo per creare l'espianto retinico.
L'incisione circonferenziale viene praticata lungo il limbus per aprire il bulbo oculare. La cornea viene rimossa tramite dissezione lungo l'incisione limbale. La lente e il vitreo vengono quindi rimossi, lasciando una coppa oculare vuota.
Tenendo la regione della testa del nervo ottico con la pinza fine, la rimozione del rivestimento esterno dell'occhio viene eseguita delicatamente. Grande attenzione durante la rimozione del mantello esterno per non ferire la retina neurale e avere la retina totalmente intatta. Quindi, la retina verrà tagliata in pezzi più piccoli.
Questo sarà un grande vantaggio, perché ti permetterà di avere un esperimento in cui il tuo gruppo di controllo e i gruppi sperimentali derivano dallo stesso animale. Tuttavia, tagliare la retina in piccoli pezzi renderà la sua gestione più impegnativa. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica per la gestione di questi piccoli pezzi retinici per garantire il corretto orientamento della coltura della retina.
Vai con la lama a forbice dissecante aperta appena sotto il pezzo di retina. Sollevare lentamente il pezzo retinico con la punta di una lama a forbice aperta e trasferirlo delicatamente sulla piastra di coltura. Gli espianti saranno trasferiti separatamente su inserti di coltura cellulare in piastre multi-pozzetto, ognuna delle quali contiene 300 microlitri di mezzi di espianto retinici con il lato della retina neurale rivolto verso l'alto.
Le colture di espianti retinici saranno mantenute in incubatori umidificati a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Assicurarsi che la superficie retinica sia rivolta verso l'alto. Se il pezzo retinico è capovolto o piegato, prova a regolarlo delicatamente con il giusto orientamento.
Il mancato posizionamento dell'espianto retinico nel giusto orientamento con la retina neurale rivolta verso l'alto comporterà il fallimento della corretta crescita delle cellule retiniche in coltura. Qui, possiamo vedere l'immunofluorescenza colorare gli espianti retinici colorati in coltura per due settimane. Gli espianti sono stati fissati e colorati con NeuN per i neuroni retinici, GFAP per le cellule gliali e lectina per i vasi sanguigni.
La colorazione ha mostrato cellule retiniche e vasi retinici ben sviluppati. Qui, possiamo vedere la colorazione a immunofluorescenza degli espianti retinici fissati e colorati con GFAP per le cellule gliali e lectina per i vasi sanguigni. Le immagini mostrano una colorazione difettosa e un sottosviluppo sia delle cellule retiniche che dei vasi retinici.
Questo perché l'espianto retinico era piegato e non era orientato correttamente sulla piastra di coltura. Grande attenzione dovrebbe essere presa per il corretto orientamento dell'espianto con la retina rivolta verso l'alto. Il fatto che il gruppo di controllo sia derivato dallo stesso singolo animale del gruppo trattato rende di grande vantaggio avere un confronto più affidabile di diverse condizioni sperimentali.
Gli impianti retinici possono fornire una piattaforma decente per studiare possibili bersagli terapeutici per un'ampia varietà di malattie della retina, come la retinopatia diabetica e le malattie degenerative della retina.
