يوفر بروتوكولنا تمييزا بين المناطق الغنية بالكولاجين والكولاجين التي تفتقر إلى أقسام الكبد. وبالتالي يمكن استخدامه لدراسة عمليات تكوين الألياف في تفاصيل أكبر. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام الفحص المجهري المستقطب لتحديد المناطق الغنية بالكولاجين في أقسام الكبد.
يمكن أن توفر بروتوكولاتنا نظرة ثاقبة لتطور تليف الكبد ، ويمكن أيضا اعتمادها للأنسجة الرخوة الأخرى مثل الرئتين بعد تحسينات معينة. للبدء ، قم بإزالة أقسام الكبد المجمدة من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وقم بإذابتها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ثبت المقاطع بالثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تليها الغسيل خمس مرات باستخدام PBS.
بعد الغسيل الأخير ، امسح PBS الزائد حول قسم الكبد باستخدام الأنسجة ، وحدد حدا يبلغ حوالي سنتيمترين في أربعة سنتيمترات حول قسم الكبد بقلم علامة كاره للماء. قم بتغطية العينة باستخدام PBS ، ثم قم بتحميل العينة على مرحلة AFM ، وقم بتغطيتها برأس AFM. في مجهر القوة الذرية أو برنامج AFM ، انتقل إلى علامة تبويب الإعداد وحدد علامة على الحفظ التلقائي لحفظ جميع الملفات تلقائيا.
ثم حدد اسم الملف والدليل لحفظ ملفات القياس بالانتقال إلى علامة تبويب الإعداد والنقر فوق حفظ الإعدادات. اقترب من سطح الأنسجة باستخدام الكابولي AFM عن طريق تشغيل الليزر والنقر على مفتاح الاقتراب. بعد اكتمال النهج ، اسحب طرف الكابولي بالنقر فوق مفتاح التراجع مرة واحدة ، والذي يسحب الكابولي إلى الطرف العلوي من نطاق بيزو.
إذا لزم الأمر ، أعد محاذاة الكاشف باستخدام مقابض على رأس AFM. أطفئ الليزر. النصيحة هي الآن في بؤرة الهدف.
بعد ذلك ، قم بتراكب المجال البصري للمجهر باستخدام خرائط قياس AFM بالنقر فوق علامة التبويب الملحقات وتحديد المعايرة البصرية المتراكبة المباشرة. في النافذة التالية ، انقر فوق التالي لالتقاط سلسلة من الصور للناتئ الذي يقوم بمسح منطقة معينة. انقر فوق التالي مرة أخرى للانتقال إلى النافذة التالية.
في الصورة الأولى ، انقر فوق وسط طرف الكابولي يدويا لتصوير موضع الطرف في البرنامج. يمكن التلاعب بحجم الدائرة التي تصور موضع الطرف من خلال الإشارة إلى نصف قطرها لزيادة الدقة. انقر فوق معايرة لاكتشاف موضع طرف الكابولي في جميع الصور تلقائيا.
تأكد من دقة اكتشاف التلميح من خلال تصفح الصور. انقر فوق التالي، ثم قم بإنهاء لإنهاء التراكب البصري. بعد ذلك ، حرك المسرح لوضع منطقة غنية بالكولاجين داخل المربع الأخضر ، مرئية في علامة تبويب عارض البيانات ، باستخدام الصورة المستقطبة.
حدد المنطقة الغنية بالكولاجين عن طريق تحديد المنطقة الموجودة أسفل علامة تبويب الشبكة ، ثم إنشاء مستطيل في علامة تبويب عارض البيانات باستخدام الضغط لفترة طويلة على زر الماوس الأيسر داخل المربع الأخضر المحدد. انقر فوق تأكيد منطقة المسح الجديدة لتعيين المنطقة المحددة كمنطقة قياس. اضبط معلمات حلقة الملاحظات.
تعيين I كسب عند 50 هرتز وكسب P عند 0.001. ثم اضبط نقطة الضبط على نانو نيوتن واحد. حدد قيمة نقطة الضبط النسبية وفقا للخواص الميكانيكية للمواد المدروسة وصلابة الكابولي.
حدد خط أساس عادل ليلائم منحنيات القوة بشكل صحيح. ثم حدد طول حركة الكابولي في المحور Z وفقا لتضاريس سطح العينة. اضبط حركة Z على مدة ثابتة.
اضبط وقت التمديد على ثانية واحدة مع تأخير التمديد والتراجع على أنه صفر. تعيين معدل العينة في 5،000 هيرتز. ضع علامة أمام الحلقة المغلقة Z لضبط المسافة بين العينة وطرف الكابولي تلقائيا أثناء القياسات.
ثم قم بفك تعشيق التحكم الآلي في المرحلة عن طريق إلغاء تحديد زر التعشيق. قم بتشغيل الليزر واقترب من العينة باستخدام الكابولي. انقر فوق بدء المسح لجمع منحنيات مسافة القوة.
تحليل البيانات المكتسبة باستخدام برنامج AtomicJ مفتوح المصدر. قم بتحميل منحنيات القوة في البرنامج بالنقر فوق منحنيات قوة العملية وأيقونة الخرائط. ثم في مساعد المعالجة ، أضف الخرائط المراد تحليلها بالنقر فوق زر الإضافة.
بعد تحميل الخرائط ، انقر فوق التالي. حدد إعدادات المعالجة في النافذة التالية. لتقدير نقطة الاتصال بين العينة والكابولي تلقائيا باستخدام مجموعة من معلمات منحنى التركيب ، استخدم التقدير التلقائي لنقطة الاتصال.
حدد نقطة الاتصال بين الكابولي والعينة بطريقة الشبكة المركزة الكلاسيكية. حدد طريقة التقدير كطريقة مستقلة للنموذج لتحقيق أفضل تحديد لنقطة الاتصال بناء على جودة منحنيات القوة المقاسة ، والتي يجب تحديدها تجريبيا أثناء تحسين تحليل البيانات. قم بتركيب منحنى المسافة البادئة للقوة باستخدام نموذج كلاسيكي مثل L Two الكلاسيكي لملاءمة النموذج.
اضبط ملاءمة النموذج على منحنى السحب. اضبط نسبة بواسون على 0.45 على النحو الموصى به للأنسجة الرخوة مثل الكبد. اضبط ملاءمة المنحنى باستخدام درجة خط الأساس ثلاثة ودرجة التلامس الواحدة واحدة.
قم بتغيير درجة الملاءمة متعددة الحدود بناء على مقياس انحرافات المنحنيات عن النموذج. حدد النموذج المستخدم لتناسب منحنيات السحب كنموذج Sneddon. املأ نصف قطر الطرف الكروي حتى ٢٫٩ ميكرومتر.
قم بتحميل ثابت الربيع و invOLS من ملفات البيانات عن طريق تمكين القراءة ، ثم انقر فوق إنهاء. بعد تحليل البيانات ، انتقل من خلال منحنيات القوة. استبعد منحنيات القوة حيث اقترب الكابولي من سطح قسم الكبد بشكل غير صحيح.
هذه المنحنيات لها ضوضاء عالية وأشكال شاذة. بعد ذلك ، يمكن نسخ البيانات أو تصديرها. في هذه الدراسة ، تم فحص أقسام الكبد الثابتة بشكل معتدل التي تم الحصول عليها من الفئران الضابطة والفئران المصابة بالتليف الخفيف والمتقدم الناجم عن حقن رابع كلوريد الكربون باستخدام AFM.
تم تحليل المناطق القريبة من الأوردة المركزية المقابلة للمناطق التي تتشكل فيها ألياف الكولاجين في فئران رابع كلوريد الكربون عادة في الكبد الضابط. كان توزيع وحدات يونغ قابلا للتكرار عبر مناطق مختلفة في مناطق التحكم في الكبد والمناطق الغنية بالكولاجين داخل قسم كبد واحد. في الفئران المعالجة برابع كلوريد الكربون ، أظهرت خرائط الصلابة المقابلة للمناطق المحيطة بالمركز لرواسب الكولاجين قيما أعلى بكثير من وحدات يونغ مقارنة بالمناطق المكافئة في الفئران الضابطة.
علاوة على ذلك ، كانت هناك زيادة كبيرة في قيم وحدات يونغ مع علاج أطول. كما تم تقييم تأثير التخزين المطول لأقسام الكبد على الخواص الميكانيكية لألياف الكولاجين. أظهرت قياسات AFM قيما أقل بكثير من وحدات يونغ في المناطق الغنية بالكولاجين للأقسام المخزنة لمدة ثلاثة أشهر ، مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها في غضون أسبوعين.
يحدد وقت تثبيت قسم الكبد بشكل كبير الخواص الميكانيكية لقسم الكبد. نوصي بالفواصل الزمنية المنصوص عليها في البروتوكول يجب اتباعها بدقة. بعد بعض التحسينات في البروتوكول ، يمكن استخدام الطريقة المحددة لأي أنسجة رخوة تظهر ترسبا كبيرا للكولاجين ، والذي يمكن اكتشافه عن طريق الفحص المجهري المستقطب.
توفر التقنية المعطاة للباحثين بروتوكولا موحدا ومريحا لدراسة آلية الكبد عبر الصحة والمرض.
