Nuestro protocolo proporciona una distinción entre áreas ricas en colágeno y áreas que carecen de colágeno en las secciones del hígado. Por lo tanto, se puede utilizar para estudiar los procesos de fibrogénesis con mayor detalle. La principal ventaja de la técnica radica en el uso de microscopía polarizadora para localizar áreas ricas en colágeno en las secciones hepáticas.
Nuestros protocolos pueden proporcionar una gran información sobre el desarrollo de la fibrosis hepática, y también se puede adoptar para otros tejidos blandos como los pulmones después de ciertas optimizaciones. Para comenzar, retire las secciones de hígado congeladas de menos 80 grados centígrados y descongélelas a temperatura ambiente durante dos minutos. Arregle las secciones con paraformaldehído al 4% frío en PBS durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, seguido de lavar cinco veces con PBS.
Después del último lavado, limpie el exceso de PBS alrededor de la sección hepática con pañuelo de papel y marque un límite de aproximadamente dos por cuatro centímetros alrededor de la sección hepática con un rotulador hidrófobo. Cubra la muestra con PBS, luego cargue la muestra en la etapa AFM y cúbrala con el cabezal AFM. En el software de microscopía de fuerza atómica o AFM, vaya a la pestaña de configuración y marque una marca en el guardado automático para guardar automáticamente todos los archivos.
Luego especifique el nombre del archivo y el directorio para guardar los archivos de medición yendo a la pestaña de configuración y haciendo clic en guardar la configuración. Acérquese a la superficie del tejido con el voladizo AFM encendiendo el láser y haciendo clic en la tecla de aproximación. Una vez completada la aproximación, retraiga la punta en voladizo haciendo clic en la tecla de retracción una vez, lo que retrae el voladizo hasta el extremo superior del rango piezoeléctrico.
Si es necesario, vuelva a alinear el detector utilizando perillas en el cabezal AFM. Apague el láser. La punta está ahora en el foco del objetivo.
A continuación, superponga el campo óptico del microscopio con mapas de medición AFM haciendo clic en la pestaña de accesorios y seleccionando la calibración óptica de superposición directa. En la ventana siguiente, haga clic en siguiente para tomar una serie de imágenes del voladizo escaneando un área específica. Haga clic en siguiente de nuevo para ir a la siguiente ventana.
En la primera imagen, haga clic en el centro de la punta del voladizo manualmente para representar la posición de la punta en el software. El círculo que representa la posición de la punta se puede manipular en tamaño indicando su radio para aumentar la precisión. Haga clic en calibrar para detectar automáticamente la posición de la punta en voladizo en todas las imágenes.
Confirme la precisión de la detección de puntas revisando las imágenes. Haga clic en siguiente y, a continuación, finalice para finalizar la superposición óptica. A continuación, mueva el escenario para colocar un área rica en colágeno dentro del cuadro verde, visible en la pestaña del visor de datos, utilizando la imagen polarizada.
Seleccione el área rica en colágeno definiendo el área en la pestaña de cuadrícula y luego haciendo un rectángulo en la pestaña del visor de datos presionando prolongadamente el botón izquierdo del mouse dentro del cuadro verde especificado. Haga clic en confirmar nueva región de escaneo para establecer el área seleccionada como área de medición. Establezca los parámetros del bucle de retroalimentación.
Establece la ganancia I en 50 hercios y la ganancia P en 0.001. Luego establezca el punto de ajuste en un nano Newton. Seleccione el valor relativo del punto de ajuste de acuerdo con las propiedades mecánicas de los materiales estudiados y la rigidez del voladizo.
Especifique una línea base justa para ajustar correctamente las curvas de fuerza. A continuación, seleccione la longitud del movimiento en voladizo en el eje Z de acuerdo con la topografía de la superficie de la muestra. Establezca el movimiento Z en duración constante.
Establezca el tiempo de extensión a un segundo con retrasos de extensión y retracción como cero. Establezca la frecuencia de muestreo en 5, 000 hertzios. Marque una marca delante del bucle cerrado Z para ajustar automáticamente la distancia entre la muestra y la punta en voladizo durante las mediciones.
A continuación, desconecte el control de escenario motorizado anulando la selección del botón de activación. Encienda el láser y acérquese a la muestra con el voladizo. Haga clic en iniciar escaneo para recopilar curvas de distancia de fuerza.
Analice los datos adquiridos utilizando el software de código abierto AtomicJ. Cargue las curvas de fuerza en el programa haciendo clic en el icono de curvas y mapas de fuerza de proceso. Luego, en el asistente de procesamiento, agregue los mapas a analizar haciendo clic en el botón agregar.
Después de cargar los mapas, haga clic en siguiente. Especifique la configuración de procesamiento en la siguiente ventana. Para estimar automáticamente el punto de contacto entre la muestra y el voladizo utilizando un conjunto de parámetros de curva de ajuste, utilice la estimación automática del punto de contacto.
Determine el punto de contacto entre el voladizo y la muestra mediante el método clásico de cuadrícula enfocada. Seleccione el método de estimación como el método independiente del modelo para obtener la mejor determinación del punto de contacto en función de la calidad de las curvas de fuerza medidas, que debe determinarse empíricamente durante la optimización del análisis de datos. Ajuste la curva de indentación de fuerza utilizando un modelo clásico como L dos clásico para el ajuste del modelo.
Ajuste el modelo a la curva de retirada. Establezca la proporción de Poisson en 0.45 como se recomienda para tejidos blandos como el hígado. Ajuste la curva utilizando un grado de referencia de tres y un grado de contacto de uno.
Cambiar el grado de ajuste polinómico en función de la escala de desviaciones de las curvas del modelo. Seleccione el modelo utilizado para ajustar las curvas de retirada como el modelo de Sneddon. Rellene el radio de la punta esférica a 2,9 micrómetros.
Cargue la constante de resorte e invOLS desde los archivos de datos habilitando la lectura, luego haga clic en finalizar. Después del análisis de datos, vaya a través de las curvas de fuerza. Excluya las curvas de fuerza donde el voladizo se acercó incorrectamente a la superficie de la sección hepática.
Estas curvas tienen mucho ruido y formas aberrantes. Después de esto, los datos se pueden copiar o exportar. En este estudio, las secciones hepáticas ligeramente fijas obtenidas de los ratones control y ratones con fibrosis leve y avanzada inducida por la inyección de tetracloruro de carbono se probaron con AFM.
Las áreas cercanas a las venas centrales correspondientes a las áreas donde generalmente se forman las fibras de colágeno en ratones con tetracloruro de carbono se analizaron en hígados de control. La distribución de los módulos de Young fue reproducible a través de diferentes regiones en hígados de control y áreas ricas en colágeno dentro de una sola sección hepática. En ratones tratados con tetracloruro de carbono, los mapas de rigidez correspondientes a las áreas pericentrales de los depósitos de colágeno mostraron valores significativamente más altos de los módulos de Young en comparación con las áreas equivalentes en ratones control.
Además, hubo un aumento significativo en los valores de los módulos de Young con un tratamiento más prolongado. También se evaluó el efecto del almacenamiento prolongado de secciones hepáticas sobre las propiedades mecánicas de las fibras de colágeno. Las mediciones de AFM mostraron valores significativamente más bajos de los módulos de Young en áreas ricas en colágeno para secciones almacenadas durante tres meses, en comparación con las obtenidas en dos semanas.
El tiempo de fijación de la sección hepática determina en gran medida las propiedades mecánicas de la sección hepática. Recomendamos que se sigan estrictamente los intervalos cronometrados establecidos en el protocolo. Después de ciertas optimizaciones en el protocolo, el método dado se puede utilizar para cualquier tejido blando que muestre una deposición significativa de colágeno, que es detectable por microscopía polarizada.
La técnica dada proporciona a los investigadores un protocolo unificado y conveniente para estudiar el mecanismo del hígado a través de sanos y enfermedades.
