הפרוטוקול שלנו מספק הבחנה בין אזורים עשירים בקולגן לבין אזורים חסרי קולגן במקטעי הכבד. לכן ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את תהליכי הפיברוגנזה בפרטים הגדולים יותר. היתרון העיקרי של הטכניקה טמון בשימוש במיקרוסקופיה מקטבת לאיתור אזורים עשירים בקולגן במקטעי הכבד.
הפרוטוקולים שלנו יכולים לספק תובנות נהדרות על התפתחות פיברוזיס בכבד, וניתן לאמץ אותו גם עבור רקמות רכות אחרות כגון ריאות לאחר אופטימיזציות מסוימות. כדי להתחיל, להסיר את קטעי הכבד קפוא מינוס 80 מעלות צלזיוס, ולהפשיר אותם בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. לתקן את החלקים עם קר כקרח 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף חמש פעמים עם PBS.
לאחר הכביסה האחרונה, נגבו את עודפי ה-PBS סביב מקטע הכבד באמצעות רקמה, וסמנו גבול של כשניים על ארבעה סנטימטרים סביב מקטע הכבד באמצעות עט טוש הידרופובי. כסה את הדגימה באמצעות PBS, ולאחר מכן טען את הדגימה על במת ה- AFM וכסה אותה בראש ה- AFM. במיקרוסקופיה של הכוח האטומי או בתוכנת AFM, עבור אל הכרטיסייה הגדרה וסמן סמן על שמירה אוטומטית כדי לשמור באופן אוטומטי את כל הקבצים.
לאחר מכן ציין את שם הקובץ והספרייה לשמירת קובצי המדידה על ידי מעבר לכרטיסייה הגדרה ולחיצה על הגדרות שמירה. התקרב למשטח הרקמה עם משטח ה- AFM על ידי הפעלת הלייזר ולחיצה על מקש הגישה. לאחר השלמת הגישה, חזור על קצה הקנטילבר על ידי לחיצה אחת על מקש הנסיגה, אשר מחזיר את הקנטילבר לקצה העליון של טווח הפיאזו.
במידת הצורך, יישרו מחדש את הגלאי באמצעות ידיות בראש ה-AFM. כבה את הלייזר. הטיפ נמצא כעת במוקד המטרה.
לאחר מכן, שכב את השדה האופטי של המיקרוסקופ במפות מדידה של AFM על ידי לחיצה על לשונית האביזרים ובחירת כיול אופטי ישיר של שכבת-על. בחלון המצליח, לחץ על הבא כדי לצלם סדרה של תמונות של הקנטילבר הסורק אזור מסוים. לחץ שוב על הבא כדי לעבור לחלון הבא.
בתמונה הראשונה, לחץ על מרכז קצה הקנטילבר באופן ידני כדי לתאר את מיקום הקצה בתוכנה. ניתן לשנות את העיגול המתאר את מיקום הקצה בגודלו על ידי ציון הרדיוס שלו כדי להגדיל את הדיוק. לחץ על כיול כדי לזהות באופן אוטומטי את מיקום קצה הכנף בכל התמונות.
אשר את הדיוק של זיהוי עצות על-ידי מעבר על התמונות. לחץ על הבא ולאחר מכן סיים כדי לסיים את השכבה האופטית. לאחר מכן, הזז את הבמה כדי למקם אזור עשיר בקולגן בתוך הקופסה הירוקה, גלוי בכרטיסייה מציג הנתונים, באמצעות התמונה המקוטבת.
בחר את האזור העשיר בקולגן על-ידי הגדרת האזור שמתחת לכרטיסיית הרשת ולאחר מכן יצירת מלבן בכרטיסיית מציג הנתונים באמצעות לחיצה ארוכה על לחצן העכבר השמאלי בתוך התיבה הירוקה שצוינה. לחצו על 'אשר אזור סריקה חדש' כדי להגדיר את האזור שנבחר כאזור מדידה. הגדר את הפרמטרים של לולאת המשוב.
סט אני מרוויח ב-50 הרץ ורווח P ב-0.001. לאחר מכן הגדר את נקודת ההגדרה בננו ניוטון אחד. בחר את ערך הנקודה היחסית שנקבע בהתאם לתכונות המכניות של החומרים הנחקרים ולנוקשות הקנטילבר.
ציין קו בסיס פשוט שיתאים כראוי לעקומות הכוח. לאחר מכן בחר את אורך תנועת הקנטילבר בציר Z בהתאם לטופוגרפיית פני השטח של הדגימה. הגדר את תנועת Z למשך זמן קבוע.
הגדר את זמן ההארכה לשנייה אחת עם עיכובים בהארכה ובנסיגה כאפס. הגדר קצב דגימה ב 5, 000 הרץ. סמן סמן לפני לולאה סגורה Z כדי להתאים באופן אוטומטי את המרחק בין הדגימה לקצה הקנטילבר במהלך המדידות.
לאחר מכן נתקו את בקרת הבמה הממונעת על ידי ביטול הבחירה בלחצן ההפעלה. הפעל את הלייזר והתקרב לדגימה עם ה- cantilever. לחץ על התחל סריקה כדי לאסוף עקומות מרחק כוח.
נתח את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנת הקוד הפתוח AtomicJ. טען את עקומות הכוח לתוכנית על ידי לחיצה על עקומות כוח התהליך וסמל המפות. לאחר מכן במסייע העיבוד, הוסף את המפות לניתוח על ידי לחיצה על כפתור ההוספה.
לאחר טעינת המפות, לחץ על הבא. ציין את הגדרות העיבוד בחלון הבא. כדי להעריך את נקודת המגע בין הדגימה לנקודת המגע באופן אוטומטי באמצעות קבוצה של פרמטרים של עקומה מתאימה, השתמש בהערכה האוטומטית של נקודת המגע.
קבע את נקודת המגע בין הקנטילבר לדגימה בשיטת הרשת הממוקדת הקלאסית. בחר את שיטת ההערכה כשיטה הבלתי תלויה במודל כדי להניב את הקביעה הטובה ביותר של נקודת המגע בהתבסס על איכות עקומי הכוח הנמדדים, אשר צריכה להיקבע באופן אמפירי במהלך אופטימיזציה של ניתוח נתונים. התאם את עקומת כניסת הכוח באמצעות מודל קלאסי כ- L 2 קלאסי להתאמת המודל.
הגדר את ההתאמה של המודל לעקומת הנסיגה. הגדר את היחס של פואסון כ- 0.45 כפי שמומלץ לרקמות רכות כגון הכבד. הגדר את ההתאמה של העקומה באמצעות דרגת בסיס של שלוש ודרגה במגע של אחת.
שנה את מידת ההתאמה הפולינומית בהתבסס על סולם הסטיות של העקומות מהמודל. בחר את המודל המשמש להתאמת עקומות המשיכה כמודל Sneddon. ממלאים את רדיוס הקצה הכדורי ל-2.9 מיקרומטר.
טען את קבוע הקפיץ ואת invOLS מקבצי הנתונים על ידי הפעלת קריאה, ולאחר מכן לחץ על סיום. לאחר ניתוח הנתונים, עבור דרך עקומות הכוח. אל תכלול את עקומות הכוח שבהן הכנף התקרבה אל פני השטח של קטע הכבד באופן שגוי.
לקימורים אלה יש רעש גבוה וצורות חריגות. לאחר מכן, ניתן להעתיק או לייצא את הנתונים. במחקר זה, מקטעי כבד קבועים קלות שהתקבלו מעכברי הביקורת ומעכברים עם פיברוזיס קל ומתקדם המושרה על ידי הזרקת פחמן טטרה-כלוריד נחקרו עם AFM.
אזורים הקרובים לוורידים המרכזיים המתאימים לאזורים שבהם נוצרים בדרך כלל סיבי קולגן בעכברי פחמן טטרה-כלוריד נותחו בכבדי בקרה. התפלגות המודולי של יאנג הייתה ניתנת לשחזור על פני אזורים שונים בכבדי בקרה ובאזורים עשירים בקולגן בתוך מקטע כבד יחיד. בעכברים שטופלו בפחמן טטרה-כלוריד, מפות קשיחות המתאימות לאזורים הפריצנטריים של מרבצי קולגן הראו ערכים גבוהים משמעותית של מודולי יאנג בהשוואה לאזורים מקבילים בעכברי בקרה.
יתר על כן, חלה עלייה משמעותית בערכים של מודולי יאנג עם טיפול ארוך יותר. כמו כן הוערכה ההשפעה של אחסון ממושך של מקטעי כבד על התכונות המכניות של סיבי הקולגן. מדידות AFM הראו ערכים נמוכים משמעותית של מודולי יאנג באזורים עשירים בקולגן עבור מקטעים שאוחסנו במשך שלושה חודשים, בהשוואה לאלה שהתקבלו תוך שבועיים.
זמן הקיבוע של סעיף הכבד קובע מאוד את התכונות המכניות של קטע הכבד. אנו ממליצים שיש להקפיד על מרווחים מתוזמנים המצוינים בפרוטוקול. לאחר אופטימיזציות מסוימות בפרוטוקול, ניתן להשתמש בשיטה הנתונה עבור כל רקמות רכות המראות תצהיר קולגן משמעותי, אשר ניתן לזיהוי על ידי מיקרוסקופיה מקטבת.
הטכניקה הנתונה מספקת לחוקרים פרוטוקול אחיד ונוח לחקר מנגנון הכבד על פני בריאים ומחלות.
