هذه الطريقة هامة لأنه يمكن استخدامها للحصول على كميات كبيرة من العظام المتمايزة تماما في المختبر. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو أنه أكثر استقرارا وآمنة ويعزل نخاع العظام في وقت أقل ومع جهود أقل مقارنة مع الإجراءات التقليدية. هذه التقنية يمكن أن توفر مصدرا مستقرا من العظام، والتي هي الكائن المهم من أمراض التمثيل الغذائي العظام، بما في ذلك هشاشة العظام، التهاب البارودوتي، والعظام البيربوستة.
مع تعديلات طفيفة، يمكن أن يكون هذا البروتوكول أيضا مناسبة للحصول على أنواع مختلفة من نخاع العظام المشتقة الخلايا في الفئران أو الحيوانات الأخرى. للبدء ، ضع الحيوانات الرحيمة على لوحة مطهرة في وضعية supine. باستخدام مقص معقمة، وجعل شق ما يقرب من سنتيمتر واحد في الطول في عظم الفخذ القريب لقشر الجلد.
بعد ذلك، تشريح من عظم الفخذ والساق. بعناية ولطف، وقطع أجزاء اتصال الثنائية حول الورك والركبة، والمفاصل الكاحل لعزل الساق والفخذ. قطع جزء من الأنسجة حول العظام، والتأكد من أن تكون شاملة.
ثم، ضع العظام النظيفة في طبق مع خمسة ملليلتر من الثقافة الكاملة المتوسطة. استخدام مقص معقمة لقطع العظام الطويلة. استخدام حقنة المليلتر واحد إبرة لطرد بعناية تجويف النخاع مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة حتى تجويف النخاع يتحول الأبيض.
نقل هذا التعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر وتصفية ذلك مع مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة الأنسجة المتبقية. إضافة خمسة ملليلتر من الدم الأحمر العازلة، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة ثماني دقائق. بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 250 مرات G لمدة خمس دقائق ل تسفر عن بيليه الخلية.
تعرق وssuspend الخلايا في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا، وحساب الوقت الذي يقضيه في الإجراءات المتخذة لهذا الأسلوب. أولاً، ضع الحيوانات الرحيمة على لوح مطهر في وضعية ية.
باستخدام مقص معقمة، وجعل شق ما يقرب من سنتيمتر واحد في الطول في عظم الفخذ القريب لقشر الجلد. بعد ذلك، تشريح من عظم الفخذ والساق. قطع أجزاء من الأنسجة حول العظام، على الرغم من أنه ليست هناك حاجة لإزالة الأنسجة تماما.
شطف الساق والعظمة مع 12 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، ثم قطع لهم في النصف. ضع الساق المقصوصة وعظم الفخذ في طرف ماصة مليلتر واحد معد، ووضع هذا في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير جاهز. جهاز طرد مركزي الأنبوب ثلاث مرات في 1،000 مرات G و أربع درجات مئوية لمدة 45 ثانية.
بعد ذلك، قم بإزالة طرف الماصات الذي يحتوي على العظم من الأنبوب، تاركاً نخاع العظم في الأنبوب. إضافة 200 ميكروليترس من برنامج تلفزيوني إلى الأنبوب، وماصة صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا لتفكك النخاع بدقة. نقل هذا التعليق الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر، وتصفية ذلك مع مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة أي الأنسجة المتبقية.
ثم استخدم مقياس الهيموسيتات لحساب الخلايا، وحساب الوقت الذي يقضيه في الخطوات التي تم اتخاذها في هذا القسم. إضافة ستة ملليلترات من محلول فصل الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المعقم. أضف تعليق الخلية المخفف إلى الأنبوب.
بعد إضافة التعليق، سيظهر حد واضح بين طبقة الخلايا وحل الفصل. بعد ذلك، التزم بطرفة ماصة إلى السطح الداخلي للأنبوب بزاوية 45 درجة. الطرد المركزي الحل الطبقات في جهاز طرد مركزي أفقي في 500 مرة G لمدة 30 دقيقة.
بعد هذا، pirate الطبقة الثانية الغائمة التي تحتوي على الخلايا المستهدفة من أعلى إلى أسفل. نقل الخلايا المستهدفة إلى أنبوب جديد. إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا، والطرد المركزي في 250 مرة G لمدة خمس دقائق.
كرر عملية الغسيل هذه عن طريق إضافة PBS والطرد المركزي لما مجموعه ثلاثة يغسل. Resuspend بيليه الخلية مع نخاع العظم تحريض المتوسطة. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا.
ثم، إضافة 5-8 ملليلتر من نخاع العظام تحريض المتوسطة للحصول على حل الخلايا النهائية من 300،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من هذا الحل الخلية إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. بعد احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، بلطف التعرق قبالة المتوسطة وإضافة ملليلتر واحد من وسط التعريفي العظام إلى كل بئر.
يهيج لوحة بلطف وإعادته إلى الحاضنة. كل 48 ساعة، وإزالة واستبدال 0.8 ملليلتر من وسط التعريفي في أوستيوكلات من كل بئر. تهيج لوحة بلطف قبل إعادته إلى الحاضنة.
للبدء في مرحلة ما قبل علاج شرائح العظام، استخدم منشار كهربائي صغير لقطع قشرة العظام الفخذية البقرية الطازجة إلى شريحتين سميكتين سنتيمتر على طول المحور الطولي. بعد قطع وطحن الشرائح، وغسل شرائح عن طريق غمر لهم في منقار من الماء الأيونية وإخضاعهم لالموجات فوق الصوتية في 100 هيرتز لمدة ساعة واحدة. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات.
تزج شرائح غسلها في 75٪ الكحول لمدة ساعتين. ثم، التعرق قبالة الكحول وفضح كل شريحة من شرائح للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على منصة نظيفة. للبدء في تلطيخ الأزرق التولويديين، ضع شرائح العظام المعالجة مسبقًا في آبار 24 بئرًا.
بعد ذلك، أضف الثقافة المتوسطة في لوحة 24 بئر لتزج شرائح العظام لمدة ساعتين. زرع والحث على الخلايا كما هو موضح سابقا. بعد ظهور العظام في أربعة إلى ستة أيام، وغسل شرائح مع ملليلتر واحد من 0.25 الوليار هيدروكسيد الأمونيوم.
سونيكات شرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل لإزالة الخلايا الحية والسماح لتحليل حفر ريسوشن على شرائح العظام. ثم، إزالة هيدروكسيد الأمونيوم وصمة عار الشرائح مع ملليلتر واحد من 1٪ toluidine حل الأزرق لكل شريحة لمدة دقيقتين. غسل شرائح وصمة عار مع برنامج تلفزيوني.
اختر عشوائيا خمس طرق عرض واستخدام برنامج تحليل الصور لإجراء تحليل شبه كمي لمنطقة إعادة الامتصاص. أولاً، بادئة شرائح العظام مع ملليلتر واحد من 2.5٪ الجلوتارالديهيد لكل شريحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. Sonicate شرائح البادئة ثلاث مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها مع واحد العث الأمونيوم هيدروكسيد لإزالة الخلايا.
ثم، إزالة هيدروكسيد الأمونيوم وغسل شرائح العظام ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، مع كل غسل دائم 12 دقيقة. إصلاح شرائح العظام غسلها مع حمض osmic 1٪ لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. تنفيذ الجفاف المتدرجة الإيثانول كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد ذلك، استبدل الإيثانول بآسيت الإيزوميل لمدة 15 دقيقة. معطف شرائح مع البلاديوم الذهب وتحليلها عن طريق مسح المجهري الإلكترون. في هذه الدراسة، تم عزل أعداد كبيرة من السلائف العظمية، وطهرت وتم حثها بنجاح لتصبح العظام.
من خلال المكمل مع M-CSF و رانكل، وينظر إلى العظام العملاقة في الأيام من خمسة إلى ستة. يتم تحديد تشكيل هذه العظام بنجاح عن طريق وصمة عار فخ. وتعتبر الخلايا الكبيرة والأرجوانية كخلة إيجابية TRAP مع نويات متعددة.
من خلال هذه الطريقة، من المعتاد الحصول على 800 من العظام التي تحتوي على ما يصل إلى 30 نواة لكل نوى في 24 بئر. مقارنةً بالأساليب التقليدية، يوفر هذا الأسلوب المحسن حوالي 20 دقيقة خلال عملية العزل بأكملها. استخدام شرائح العظام لتقييم نشاط إعادة الامتصاص العظام هو طريقة نموذجية في المختبر.
من خلال تلطيخ الأزرق التولويدي، يتم تصور منطقة resorption كالأخضر الفاتح. يمكن ملاحظة بنية وخصائص حفر العظام بوضوح عن طريق مسح المجهر الإلكتروني. إنّ نسبة النقر إلى الظهور، وهي واحدة من علامات خلايا العظام المحددة، أمر بالغ الأهمية لتحديد العظام ودراسة تكوين العظام في العظام.
التعبير الإيجابي لـ CTR يحدد بشكل واضح عظام العظام ويميزها عن البوليكاريونات الضامة. يشار بوضوح CTR في مقايسات المناعة من قبل لون أخضر، في حين يشير الأزرق نواة الخلية. تأكد من عدم كسر عظم الفخذ والنخاع لتجنب فقدان نخاع العظم.
الفرد الذي لم يسبق له أن أجرى هذه التقنية من قبل قد النضال عند مساعدة الخلايا الحل العملية. يجب أن يتم الالتزام بطرفة الماصات بالسطح الداخلي للأنبوب والاحتفاظ بها بزاوية 45 درجة إلى السطح الداخلي.
