بروتوكول إنقاذ الأجنة إلزامي لتجديد الأجنة غير الناضجة المشتقة من التهجينات بين الأنواع المختلفة من القرعيات. يستخدم بشكل شائع للتهجين بين القرعيات الموشاتا والقرعيات بيبو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها.
يستخدم البروتوكول وسائط MS فقط مع المضادات الحيوية. وبالتالي ، يمكن تكرارها بسهولة من قبل أي مختبر. سيكون من الممكن تعديل هذه التقنية للتحقيق في الحواجز المختلفة أمام التهجين بين الأنواع أو بين الأنواع.
سيكون الاهتمام بالتفاصيل خلال كل خطوة مفيدا للحصول على نتيجة ناجحة. ابدأ بزراعة نباتات القرعيات عن طريق ملء 50 خلية تبدأ من 25 × 50 سم باستخدام وسط تأصيص مكمل بأسمدة النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم الكاملة ، والتي تحتوي على 1.38 جرام لكل كيلوغرام من النيتروجين والفوسفور والبوتاسيوم لكل منها. بعد ذلك ، زرع البذور على عمق يساوي طولها وقم بتغطيتها بوسط التأصيص.
سقي الشقق دون إنشاء مياه راكدة وحافظ على رطوبة الوسائط عن طريق سقيها مرة واحدة يوميا. في نهاية مرحلة الورقة الحقيقية الثانية ، قم بزرع الشتلات في أواني قطرها 30 سم تستكمل بثلاث ملاعق كبيرة من الأسمدة الكاملة لكل وعاء. بعد كل سبعة أيام ، قم بتخصيب كل وعاء ب 500 مل من الأسمدة السائلة التي تحتوي على 20 و 20 و 20 نيتروجين وفوسفور وبوتاسيوم في غرام واحد يضاف إلى جالون من الماء.
الحفاظ على النباتات في الدفيئة في درجات حرارة تتراوح بين 22 إلى 28 درجة مئوية تحت نظام الضوء الطبيعي. بالنسبة للأنماط الوراثية للكرم ، قم بتوفير تعريشة داعمة في الدفيئة. قم بإجراء التهجين أو التلقيح المتحكم فيه بمجرد أن تبدأ النباتات في الإزهار في ستة إلى ثمانية أسابيع من البذر.
تحقق من الزهور غير المفتوحة ذات اللون الأصفر على البتلات ، وحدد الزهور الذكور والزهور الأنثوية من أصناف Cucurbita pepo و Cucurbita moschata. لمنع التلقيح العرضي للحشرات ، قم بلصق الزهرة المغلقة برفق في الأعلى باستخدام شريط لاصق. في صباح اليوم التالي ، قم بإجراء التلقيح قبل الساعة 10:00 صباحا عن طريق إزالة الجزء العلوي المسجل برفق من الزهرة الذكرية والأنثوية.
فصل البتلات عن الزهرة الذكرية ، ونقل حبوب اللقاح عن طريق فرك العضو الآخر برفق على وصمة الزهرة الأنثوية. بعد التلقيح ، أغلق الزهرة الأنثوية الملقحة على الفور بشريط لاصق ، واستخدم علامة لتسجيل تاريخ التلقيح وللإشارة إلى الوالدين من الأب والأم المستخدمة في الصليب. سيشكل الصليب الناجح المشار إليه بواسطة مبيض موسع ثمرة صغيرة في غضون أسبوع واحد.
حصاد الفاكهة بعد 45 إلى 55 يوما من التلقيح. تحضير مخزون سيفوتاكسيم. قم بتصفيته من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرون.
واحصل على 0.5 ملليلتر من القسمة تساوي 250 ملليجرام لكل سيفوتاكسيم ملليلتر قبل تخزينها عند 20 درجة سلزية تحت الصفر. وبالمثل ، تحضير مخزون الأمبيسلين. قم بترشيحه من خلال مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرون وقم بإعداد حصة ملليلتر واحدة من 100 ملليغرام لكل ملليلتر أمبيسلين قبل تخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.
تحضير Murashige و Skoog ، أو MS المتوسطة عن طريق إذابة 2.45 غرام من الوسط في 500 ملليلتر من الماء المقطر في زجاجة لتر واحد. أضف 1.5 جرام من صمغ الجلان إلى وسط MS وقم بالتوقيمه عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتبريد الوسط عن طريق وضع الزجاجة في حمام مائي عند 50 درجة مئوية.
قم بإذابة مخزون المضادات الحيوية داخل خزانة التدفق الصفحي. انقل الزجاجة المتوسطة إلى غطاء التدفق الصفحي وأضف 0.6 ملليلتر من مرق سيفوتاكسيم و 0.25 ملليلتر من مخزون الأمبيسلين إلى الوسط مع الخلط المناسب. صب حوالي سبعة ملليلتر من الوسط في طبق بتري معقم 60 × 15 ملم.
اترك الوسط يتجمد في أطباق بتري لمدة 15 إلى 20 دقيقة تقريبا. أغلق أطباق بتري بغلاف مانع للتسرب وضعها في صندوق تخزين في درجة حرارة الغرفة حتى يتم استخدامها مرة أخرى. احصد فاكهة القرع عن طريق قطعها عن الكرمة الرئيسية وتطهير الفاكهة عن طريق غسل سطحها في حوض المختبر باستخدام منظف سائل مثل 0.3٪ كلوروكسيلينول.
اشطف الفاكهة بماء صنبور وافر وجففها بمناشف ورقية نظيفة قبل نقل الفاكهة إلى خزانة تدفق الهواء الرقائقي. تعقيم سطح الفاكهة داخل مجلس الوزراء عن طريق رش 70 ٪ من الإيثانول. شطر الفاكهة بسكين معقم واستخرج البذور.
استخدم ملقط معقم أو أيدي مع قفازات معقمة لفتح طبقة البذور بشكل معقم وكشف الأجنة غير الناضجة قبل وضعها في طبق بتري يحتوي على MS Medium المكمل بالمضادات الحيوية. أغلق ألواح بتري باستخدام فيلم التغليف وضعها في غرفة نمو بدرجة حرارة 25 درجة مئوية وفترة تصوير 16 ساعة ورطوبة نسبية 70٪. في حالة التلوث ، قم على الفور بزراعة الأجنة غير الملوثة في صفيحة جديدة لها نفس الوسيط.
بمجرد نمو الجذور بعد 10 إلى 14 يوما ، وتطور النبتات بعد 15 إلى 21 يوما ، قم بإزالة النباتات من أطباق بتري ، واغسل برفق الوسائط الموجودة حول الجذور باستخدام ماء الصنبور. ضع النباتات النظيفة في وعاء بلاستيكي 14 × 9 × 4 سم وقم بتغطية الجذور بمناشف ورقية مبللة. قم بتغطية الحاوية وأعد ترطيب المناشف الورقية عند الضرورة.
احتفظ بالحاويات البلاستيكية عند 25 إلى 28 درجة مئوية ، وفي فترة تصوير مدتها 16 ساعة للتأقلم مع النباتات مع الحفاظ على الحالة الرطبة للمناشف الورقية. بعد 7 إلى 10 أيام من التأقلم ، انقل الشتلات التي يبلغ طولها من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات إلى 50 خلية تحتوي على مزيج تأصيص تجاري معدل بالأسمدة وانقلها إلى الدفيئة. تجنب الإفراط في الري لمنع التعفن وأضف ما يقرب من 10 إلى 20 ملليلتر من الماء لكل خلية حسب الحاجة.
في المرحلة الثانية إلى الثالثة من الأوراق الحقيقية ، قم بزرع الشتلات في أواني قطرها 25 سم مملوءة بوسط تأصيص معدل بالأسمدة وقم بإجراء تهجين متحكم فيه عندما تبدأ النباتات في الإزهار. الحفاظ على النباتات في الدفيئة في 22 إلى 28 درجة مئوية تحت نظام الضوء الطبيعي. وتقييم النباتات لخصائص الفاكهة والبذور.
تم اختيار أربعة Cucurbita pepo و 11 Cucurbita moschata للتهجين بين الأنواع. من بين 24 مجموعة متقاطعة بين الأنواع تمت تجربتها ، تم الحصول على مجموعة فواكه ل 22 تهجينا تمثل أكثر من 92٪ نجاح في مجموعة الفاكهة. لم تنتج التهجينات بين Cucurbita moschata و Cucurbita pepo التي تتضمن الأنماط الجينية O و M ، والأنماط الجينية E و J ، ثمارا ناضجة.
في حين أن التهجين بين Cucurbita moschata و Cucurbita pepo الذي يتضمن الأنماط الجينية F و J ، أنتج ست ثمار. تراوح عدد الأزهار الملقحة لمجموعات متقاطعة مختلفة من 1 إلى 11. وتراوح معدل نجاح التلقيح من 0٪ إلى 100٪ من بين 44 فاكهة تم إنتاجها من جميع المجموعات المتقاطعة ، فاكهة واحدة فقط من تهجين بين Cucurbita moschata و Cucurbita pepo ، أنتجت الأنماط الجينية C و J أجنة غير ناضجة يمكن إنقاذها.
لتطوير هذه الأجنة ضعيفة النمو ، تم استزراعها باستخدام وسائط إنقاذ الأجنة ، مما أدى إلى معدل نجاح بنسبة 80٪ لإنقاذ الأجنة. أهم إجراءين هما تحديد التهجينات المتوافقة بين نوعين وهما Cucurbita moschata و Cucurbita pepo ، وتجديد الأجنة بنجاح. نظرا لأن تقنية إنقاذ الأجنة بسيطة ويمكن تكرارها بسهولة ، يمكن لمربي القرع في جميع أنحاء العالم استخدام هذه التقنية لإنقاذ الأجنة غير الناضجة المشتقة من التهجين بين الأنواع المختلفة من القرعيات.
