يقدم هذا البروتوكول أقل تكلفة وأقل الطرق التقنية لخدمة الشيخوخة في elegans البحر. كائن حي نموذجي مؤثر في بيولوجيا الشيخوخة. أكبر ميزة لهذه الأساليب هي سهولة التنفيذ ، باستخدام معدات ومواد منخفضة التكلفة.
جعلها قابلة لأي باحث بغض النظر عن الخبرة أو التمويل المتاح. كما دراسات الشيخوخة القديمة هناك تباين طبيعي في الصحة بين السكان. لذلك ، من الضروري إجراء التجارب على صحية وجيدة التغذية ومتزامنة بإحكام.
لضمان إعاقة التمزق ابدأ في إعداد وسائط نمو الديدان الخيطية سعة لتر واحد أو لوحة مثقاب NGM. أضف 2.5 جرام من نغمة البيب و 3.0 جرام من كلوريد الصوديوم و 20 جراما من المثقاب إلى قارورة سعة لتر واحد مع شريط تحريك وأضف الماء المقطر إلى الحجم النهائي البالغ 970 ملليلتر. قم بتعقيم محلول مثقاب NGM في قارورة سعة لتر واحد باستخدام الأوتوكلاف القياسي أو معقم الوسائط.
واترك المحلول يحرك حتى يبرد إلى 60 إلى 75 درجة مئوية. بينما يبرد المحلول ، قم بتسخين حمام الخرز إلى 65 إلى 70 درجة مئوية. بمجرد أن يبرد محلول مثقاب NGM إلى 60 إلى 75 درجة مئوية.
أضف المضافات السائلة واترك المحلول يخلط تماما لمدة خمس دقائق. ثم اغمر القارورة في حمام خرز عند 65 إلى 70 درجة مئوية لمنع الوسائط من التصلب أثناء سكبها في اللوحة. ماصة تسعة إلى 11 ملليلتر من المحلول في كل لوحة 60 ملليلتر.
عند الانتهاء ، ضع الماصة مرة أخرى في المحلول الساخن للحفاظ على درجة الحرارة ومنع أي وسائط من التصلب في الماصة. كرر الإجراء لجميع اللوحات واسمح ل NGM بتصلب الألواح بين عشية وضحاها. بمجرد تصلبها ، استخدمها لبذر الألواح بالبكتيريا أو تخزين الألواح في حاويات مغلقة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر عند أربع درجات مئوية لمزامنة الديدان عن طريق التبييض.
جمع الديدان الخيطية عن طريق صب كمية صغيرة من محلول M9 على طبق يحتوي على الديدان دون الإفراط في ملء طبق بتري. ثم قم بتدوير محلول M nine بلطف لتخفيف الديدان من المروج البكتيرية. بعد ذلك ، قم بجمع الديدان الودائية البالغة في أنبوب 15 ملليلتر باستخدام ماصة مصلية.
تجنب ثقب المثقاب بطرف الماصة. قم بتكوير الحيوانات بواسطة centr لمدة 30 ثانية عند 1100 مرة G ، وقم بشفط supernatant. أضف خمسة ملليلترات من محلول التبييض الطازج إلى حبيبات الدودة ، وتحقق من الديدان تحت مجهر تشريح كل بضع دقائق مع اهتزاز قوي متقطع حتى يتم إذابة جميع أجسام الدودة البالغة ولا يترك سوى البيض في المزيج.
بعد ذلك ، قم بتكوير البيض عن طريق تدوير مزيج تبييض البيض لمدة 30 ثانية عند 1100 مرة G وشفط محلول التبييض. ثم اغسل البيض الحبيبي عن طريق إضافة ما يصل إلى 15 ملليلتر من محلول M9 وعكس الأنبوب أربع أو خمس مرات لتفريق البيض والمحلول. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 ثانية بسرعة 1100 مرة G لتكوير البيض وشفط محلول M9.
قم بإجراء الغسيل أربع مرات للقضاء على أي مبيض من مزيج البيض. بعد الغسيل الرابع ، يستنشق المحلول M9 من 100 ميكرولتر إلى ملليلتر اعتمادا على العدد الإجمالي للديدان المبيضة. هز البيض جيدا لتفتيت الكتل والتأكد من إعادة تعليق البيض بالكامل في محلول M9.
بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون الحيوانات L واحدة تم القبض عليها من أجل تزامن زمني أكثر إحكاما عن طريق إضافة 10 إلى 12 ملليلتر من محلول M9 إلى حبيبة البيض في أنبوب مؤرخ 15 ملليلتر. دع الديدان تدور في دوار لمدة تصل إلى 24 ساعة عند 20 درجة مئوية. لتقريب البيضة أو L ماصة تركيز واحد أربعة ميكرولترات من خليط البيض على لوحة NGM يجلس مع البكتيريا.
ثم عد وحساب البيض الموجود لكل ميكرولتر من الوسائط. كرر العد ثلاث أو أربع مرات لتحسين التقريب ، بناء على لوحة التقريب ، العدد المناسب من البيض أو L واحد من الحيوانات الموقوفة على صفيحة المثقاب NGM المزروعة بالبكتيريا المختارة. لقياس سلوك قاطرة الديدان عن طريق السحق.
انقل عددا صغيرا من الديدان البالغة في اليوم الأول من صفيحة مثقاب NGM إلى 10 إلى 20 ميكرولتر من محلول M9 تحت نطاق تشريح. ثم ركز على دودة واحدة في كل مرة واحسب عدد المرات التي تتحول فيها العينة من تكوين مقعر إلى تكوين محدب في 15 ثانية. استخدم عداد يدوي ومؤقت وكرر الإجراء ل 10 إلى 15 ديدانا.
عمر الديدان إلى العمر المطلوب وتكرار قياسات السحق في جميع الأعمار المرغوبة. كما هو متصور ، تسحق الديدان الأكبر سنا بسرعات أبطأ بكثير. لقياسات الكمية والخصوبة.
في 10 إلى 15 ديدان Caenorhabditis elegans ، قم بفرد L Four worms في صفيحة مثقاب NGM منفصلة مزروعة بالبكتيريا المفضلة. اسمح للحيوانات بالنمو بين عشية وضحاها عند 20 درجة مئوية وتأكد من أن مجموعة من الألواح المزروعة حديثا جاهزة لليوم التالي. لقياس كمية البيض التي يضعها Caenorhabditis elegans ، قم بنقل الديدان البالغة إلى شفرة مثقاب NGM طازجة مبذرة بالبكتيريا المنهوبة كل 12 إلى 24 ساعة لمدة سبعة إلى ثمانية أيام أو حتى لا يكون البيض مرئيا ويحسب عدد البيض الموضوع على الأطباق.
لقياس حجم الحضنة من Caenorhabditis elegans نقل الديدان البالغة إلى صفيحة مثقاب NGM طازجة مبذرة بالبكتيريا كل 12 إلى 24 ساعة ، أو سبعة إلى ثمانية أيام أو حتى لم يعد النسل مرئيا. احتفظ بجميع الأطباق التي تحتوي على البيض عند 20 درجة مئوية. بعد يومين من نقل الديدان.
عد النسل المتطور على اللوحة. عد جميع الديدان الحية والمتطورة في المرحلة الرابعة L أو قبل ذلك للتأكد من أن الجيل الثاني F لا يربك النتائج. قم بإزالة جميع الديدان من اللوحة أثناء عدها.
حافظ على الألواح لمدة يوم أو يومين إضافيين قبل تسجيلها مرة أخرى لضمان عدم تفويت أي تعاني من تأخر الفقس أو التطور. أظهر تأثير طريقة التعقيم على عمر الديدان الخيطية N2 من النوع البري أن التغيرات في عمر الديدان المزروعة على ألواح مثقاب NGM كانت مماثلة لتلك التي حدثت في الديدان المزروعة على ألواح FUDR المثقاب NGM أو GLP أربعة متحولة BN2 نمت على ألواح مثقاب NGM. أظهر HSF واحد قصير العمر انخفاضا كبيرا في العمر لجميع الظروف.
تم العثور على انخفاض كبير في عدد البيض الموضوع وحجم الحضنة في HSF واحد على الحيوانات التعبير مقارنة بضوابط النوع البري. أظهرت بعض HSF واحدة على الحيوانات التعبير العقم الكامل مما يشير إلى أن الصحة الإنجابية يمكن أن ترتبط عكسيا مع طول العمر. وفر معدل السحق طريقة موثوقة لقياس الصحة أثناء الشيخوخة كما تم قياسها من خلال انخفاض كبير في سحق الحيوانات القديمة مقارنة بالحيوانات الصغيرة.
البقاء على قيد الحياة للإجهاد هي اختبارات موثوقة لقياس صحة الكائنات الحية ، Tunicamycin الذي يسبب الإجهاد الشبكي أدى إلى انخفاض العمر بغض النظر عن التركيز مقارنة بالتحكم في DMSO. المستويات العالية من الباراكوات قصرت بشكل كبير من العمر بينما زادت التركيزات المنخفضة من الباراكوات من العمر بسبب التأثير الهرموني. في اختبارات التسامح الحراري ، زاد التعبير الزائد عن HSF one من التسامح الحراري عند 37 درجة مئوية لجميع تجارب العمر والشيخوخة.
من المهم أن نتذكر أن تقنيات التعقيم يمكن أن يكون لها تأثير متعدد الأطراف على صحة الكائنات الحية ، مما يؤثر على النتائج. توجد العديد من الأساليب الإضافية والمجانية لقياس المدى الصحي إذا كانت المعدات والبنية التحتية متوفرة بما في ذلك قياسات النسخ وتجميع بروتين الترجمة والعضيات والمورفولوجيا ووظائف التمثيل الغذائي.
