يصف هذا البروتوكول كيفية فحص البكتيريا التي لها تأثير على مقاومة الإجهاد الحراري التأكسدي C.elegans في سلالتين من C.elegans على 48 عزلة بكتيرية بالتوازي. هذا النهج متعدد الاستخدامات وقابل للتطوير. يوفر فحصا سريعا لحالات متعددة مع تأثير على C.elegans ضد الصحة ، وهو ما ينطبق على دراسة آليات الصحة والأمراض.
باستخدام مقاومة الإجهاد كبديل للصحة ، فإن خط الأنابيب هذا قابل للتطبيق بسهولة على الفحص قبل السريري للأدوية ومضادات القيء والبروبيوتيك على نماذج الديدان الخيطية الطافرة والضربة القاضية والمعدلة وراثيا والأمراض. القدرة على اختبار العديد من الحالات بالتوازي تمكن من دراسة التفاعلات المعقدة المعنية وتخدم العمليات الفسيولوجية. وتشمل هذه تفاعلات ميكروب المضيف ، واضطرابات التمثيل الغذائي ، ومعالجة الإجهاد ، والشيخوخة.
من الأهمية بمكان تجنب التلوث طوال الوقت. لا تسمح للديدان بنفاد الطعام ، وقم بتنفيذ الخطوات الرئيسية بمجرد وصول الديدان إلى المرحلة المطلوبة. ابدأ بإعداد مزرعة بكتيريا E.coli OP50 المركزة عن طريق تلقيح أربع زجاجات سعة لتر واحد من مرق الليزوجيني مع ملليلتر من مزرعة بداية OP50 لكل منها.
ثم ضع الزجاجات في حاضنة اهتزاز لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية و 160 جم ، تليها تكوير البكتيريا عند 3057 جم و 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكريات بستة ملليلتر من وسط OP50. جمع الثقافة المركزة في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر.
قم بتلقيح ثماني صفائح NGM بطول ستة سنتيمترات لكل سلالة باستخدام 100 ميكرولتر من ثقافة OP50 المشبعة المزروعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية لكل طبق. ثم احتفظ بالأطباق عند 20 درجة مئوية لمدة يومين قبل الاستخدام. ثم اقطع قطعة أجار مربعة بحجم 0.5 سم بالديدان من صفيحة NGM التي تم تجويعها مؤخرا باستخدام مشرط ، وانقلها إلى كل من ألواح NGM الثمانية الملقحة التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات.
احتضان هذه اللوحات عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك ، أعد تعليق الديدان عن طريق إضافة ما يصل إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت M تسعة المعقم إلى ألواح NGM التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات باستخدام ماصة P1000 ، وجمع محلول الدودة من جميع الألواح الثمانية لكل سلالة في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلتر. ثم جهاز طرد مركزي عند 142 مرة G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة P5000 أو مضخة مياه مجهزة بماصة أو طرف باستور معقم.
بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من المخزن المؤقت M تسعة المعقم لغسل حبيبات الدودة. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية ونقل الديدان إلى لوحة NGM ملقحة OP50 بطول 15 سم مكملة ب OP50 مركزة باستخدام ماصة. قم بزراعة كل سلالة من الدودة على صفيحة NGM قطرها 15 سم لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام عند 15 درجة مئوية عن طريق إعادة تغذية الديدان ب 0.5 ملليلتر من OP50 المركز يوميا.
بعد جمع وغسل مخزن M تسعة ، انقل كل مزرعة سلالة من الدودة إلى المزيد من ألواح NGM ، وانشر الديدان عند 20 درجة مئوية حتى يصبح 95٪ من السكان بالغين جاذبين. ثم قم بتبييض الديدان البالغة الجاذبة باتباع طريقة تحضير البيض القياسية ، وانقل البيض إلى لوحين NGM غير مصنفين بطول 15 سم لمدة 24 ساعة عند 15 درجة مئوية للسماح لجميع يرقات L one بالفقس والنمو بشكل متزامن في الخطوات اللاحقة. أولا ، اجمع كل الكتلة البكتيرية التي نمت سابقا على صفيحة أجار LB بطول ستة سنتيمترات ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من M تسعة عازلة.
ثم دوامة أنبوب الطرد المركزي الدقيق حتى يتم إعادة تعليق الكريات البكتيرية بالكامل. بعد ذلك ، قم بالدوران لأسفل عند 9،300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة 700 ميكرولتر من المادة الطافية. مرة أخرى إعادة تعليق بيليه البكتيرية عن طريق دوامة.
بعد ذلك ، انقل 200 ميكرولتر من كل معلق بكتيري إلى بئر واحد من صفيحة بئر معقمة فارغة 96. من هذه اللوحة ، قم بتلقيح ثمانية ألواح أغاروز NGM 96 جيدا ب 10 ميكرولتر من المحلول البكتيري باستخدام ماصة متعددة القنوات ، واحتضانها مع الغطاء عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، أغلق لوحة تعليق البئر 96 بغشاء سقف لاصق نظيف ، وقم بتخزينها عند 15 درجة مئوية لمدة تصل إلى خمسة أيام.
للبدء ، قم بتقييم المرحلة التنموية لمجموعة الديدان المتزامنة من خلال النظر إلى اللوحات. بمجرد وصول أكثر من 90٪ من الديدان إلى المرحلة الأربع L ، اجمع الديدان في ما يصل إلى 10 ملليلتر من محلول M تسعة المعقم في أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر. بعد ذلك ، اغسل الديدان على نطاق واسع لمدة أربع مرات عن طريق الدوران لأسفل عند 142 مرة G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية ، مع إضافة 10 ملليلتر من M 9 المعقم الطازج بين كل غسلة للتخلص من بكتيريا OP50.
ثم قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الدودة في 10 ملليلتر من M تسعة. انقل 50 ميكرولترا من محلول الدودة إلى أنبوب ربط سطحي منخفض سعة 1.5 أو ملليلتر يحتوي على 950 ميكرولتر من M تسعة. بعد خلط محتويات الأنبوب برفق لتجنب ترسيب الديدان ، استخدم بسرعة طرف ماصة منخفض الربط مبلل لنقل ثلاث إلى أربع قطرات منفصلة سعة 10 ميكرولتر على شريحة زجاجية أو لوحة NGM.
تحت مجهر ستيريو بتكبير 16X ، عد عدد الديدان ومتوسط العد من ثلاث إلى أربع قطرات لتحديد عدد الديدان لكل ميكرولتر في محلول الدودة. اضبط تركيز الدودة على 15 دودة لكل ميكرولتر في الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلتر. ثم انقل ثمانية ميكرولترات من محلول الدودة إلى كل من آبار ألواح الأغاروز NGM الثمانية 96 باستخدام ماصة متعددة القنوات أو ماصة متكررة.
بعد 36 ساعة ، قم بتوزيع 30 ميكرولتر من M تسعة في كل بئر من لوحة البئر 96. بعد ذلك ، قم بنقل الديدان إلى لوحة البئر 384 وفقا للتخطيطات المحددة باستخدام نصائح الاحتفاظ المنخفضة ، مما يضمن إعداد قارئات الألواح بشكل صحيح. بعد ذلك ، قم بتعبئة 384 لوحة بئر بأكثر من M تسعة ، بهدف الحصول على حجم نهائي يبلغ 60 ميكرولترا لكل بئر عن طريق إضافة 40 ميكرولترا من M تسعة لفحص الإجهاد الحراري و 34 ميكرولترا من M تسعة في ستة ميكرولتر من TBHP للإجهاد التأكسدي الناجم عن TBHP.
ثم ابدأ الفحص في غضون دقيقتين من إضافة TBHP. بعد ذلك ، أغلق الألواح بغطاءها الشفاف ، وأغلق حواف ألواح البئر البالغ عددها 384 بشريط لاصق ، مما يضمن عدم مرور الشريط فوق الغطاء أو أسفل اللوحة. ثم أدخل اللوحة في قارئ اللوحة.
حدد قيمة مضان دونها لن تختلف الذروة اختلافا كبيرا عن الضوضاء ، ولاحظ أقرب نقطة زمنية عندما تضعف تقلبات التألق قبل الارتفاع. ثم لاحظ النقاط الزمنية التي من المتوقع أن تنخفض بينها قيم التألق الدنيا والقصوى ، حيث سيتم استخدامها لتركيب المنحنى. بعد ذلك ، تحقق مما إذا كانت سعة قمم التألق تختلف اختلافا كبيرا بين الآبار.
قم بتطبيع البيانات قبل إجراء مزيد من التحليل باستخدام الصيغة كما هو موضح في المخطوطة. أولا ، قم بتنزيل LFASS من GitHub ، وقم بتشغيل MATLAB ، وانتقل إلى مجلد LFASS. ثم اكتب مجلد fit وقم بتشغيله في نافذة الأوامر ، باتباع التعليمات التي تظهر على الشاشة.
بعد الكتابة في المجلد ملائم، اكتب اسم مجلد البيانات الذي يوجد به ملف Excel باسم بياناتي. ثم أدخل اثنين للفاصل الزمني بين القياسات المتتالية في البروتوكول الحالي ، واكتب قيمة عتبة الضوضاء. بعد ذلك ، قم بتعيين عتبة التسامح العليا عن طريق كتابة 0.94 ، وعتبة التسامح الأدنى عن طريق كتابة 0.06 لتقييد الملاءمة السيني.
اضبط الفواصل الزمنية للعثور على القيم القصوى والدنيا. لفحص النوبات المتقاربة بصريا، اكتب Y ل yes أو N ل "لا" لعدم عرض منحنيات ملائمة وسلسة عند مطالبتك بذلك. بعد ذلك ، قم بتوفير حدود زمنية جديدة ودنيا وأعلى لمحاولة التجديد.
إذا كنت ترغب في محاولة التجديد، اكتب اثنين. ولكن إذا كنت ترغب في قبول التجديد والانتقال إلى المنحنى التالي ، فاكتب صفر. من أجل اختيار ما إذا كنت تريد تحليل المنحنيات المحددة على أنها ضوضاء أو تجديد المنحنيات غير الملائمة ، إما النوع Y للموافقة و N للرفض.
بعد محاولة التجديد أو رفضه لجميع المنحنيات المتبقية ، ينتهي البرنامج. استرجع ملفات النتائج من مجلد النتائج ، واحفظها كنقطة XLSX لتحليل المصب. تم إجراء فحوصات مقاومة الحرارة والإجهاد التأكسدي على ديدان بريستول N من النوع البري ، والتي تم تغذيتها إما على العزلات البكتيرية MYB11 أو MYB115 أو بكتيريا التحكم في E coli OP50.
بعد 36 ساعة ، تعرضت مجموعات الديدان البرية البالغة لإجهاد حراري 42 درجة مئوية و 7٪ إجهاد تأكسدي ناتج عن TBHP. تراوح متوسط وقت الوفاة بين 40 إلى 130 دقيقة لفحص الإجهاد الحراري ، وبين 90 إلى 240 دقيقة لفحص الإجهاد التأكسدي. للتأكد من نمو الديدان في الخطوة 2.5 ، وقد تستغرق الخطوة 2.1 ما يصل إلى ساعتين ، ارسم تخطيطا للوحة لإعداد الديدان من 96 بئرا إلى 284 لوحة بئر في الخطوة 4.6.
يمكن إضافة الخطوات أو استبدالها. على سبيل المثال ، يمكن إجراء شاشات الحمض النووي الريبي العريضة لجينوم المضيف أو الشاشات الجينية البكتيرية عن طريق استبدال عزلات بكتيريا الأمعاء باستنساخ RNI أو الطفرات البكتيرية على التوالي. لذلك نحن نستخدم هذا النهج حاليا لتحديد البروبيوتيك الجديد والكشف عن الشبكات التنظيمية الجينية المشاركة في التفاعلات الدقيقة المضيفة في سياق العدوى والشيخوخة.
