Этот протокол представляет собой самые дешевые и самые низкие технологические методы для обслуживания старения в морских элеганах. Влиятельный модельный организм в биологии старения. Наибольшим преимуществом этих методов является простота реализации, использование недорогого оборудования и материала.
Делая их поддающимися любому исследователю, независимо от опыта или доступного финансирования. В старых исследованиях старения наблюдается естественная изменчивость здоровья в популяциях. Поэтому важно, чтобы эксперименты проводились на здоровых, хорошо сытых и плотно синхронизированных животных.
Для обеспечения нарушения разрыва начните приготовление одной литровой среды роста нематоды или шнековой пластины NGM. Добавьте 2,5 грамма пеп-тонуса, 3,0 грамма хлорида натрия и 20 грамм шнека в литровую колбу с перемешивающим батончиком и добавьте дистиллированную воду до конечного объема 970 миллилитров. Стерилизуйте раствор шнека NGM в литровой колбе с помощью стандартного автоклава или стерилизатора среды.
И дайте раствору перемешаться, пока он не остынет до 60-75 градусов цельсия. Пока раствор остынет, нагрейте бисерную ванну до 65-70 градусов по Цельсию. После этого шнековый раствор NGM охлаждается до 60-75 градусов цельсия.
Добавьте жидкие добавки и дайте раствору полностью перемешаться в течение пяти минут. Затем погрузите колбу в бисериновую ванну при температуре от 65 до 70 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить затвердевание среды при заливке в тарелку. Пипетка от девяти до 11 миллилитров раствора в каждую 60-миллилитровую пластину.
Когда все будет готово, поместите пипетку обратно в нагретый раствор, чтобы поддерживать температуру и предотвратить затвердевание любых сред в пипетке. Повторите процедуру для всех пластин и дайте пластинам NGM затвердеть в течение ночи. После затвердевания используйте их для посева пластин с бактериями или храните пластины в герметичных контейнерах до трех месяцев при четырех градусах Цельсия, чтобы синхронизировать червей с помощью отбеливания.
Соберите нематод, вылив небольшое количество раствора M9 на тарелку, содержащую червей, не переполняя чашку Петри. Затем осторожно закрутите раствор М девять, чтобы ослабить червей с бактериальных газонов. Затем соберите взрослых гравидных червей в 15-миллилитровую трубку с серологической пипеткой.
Избегайте прокалывания шнека наконечником пипетки. Гранулируйте животных центром в течение 30 секунд при 1100 G и аспирируйте супернатант. Добавьте пять миллилитров свежеприготовленного отбеливающего раствора в гранулу червя и проверяйте червей под рассекающим микроскопом каждые несколько минут вместе с прерывистым энергичным встряхиванием, пока все тела взрослых червей не растворятся и в смеси не останутся только яйца.
Затем гранулируйте яйца, вращая смесь яичного отбеливателя в течение 30 секунд при 1100 g и аспирируйте отбеливающий раствор. Затем промыть гранулированные яйца, добавив до 15 миллилитров раствора М9 и перевернув трубку четыре или пять раз, чтобы диспергировать яйца и раствор. Опять же, центрифугируйте трубку в течение 30 секунд при 1100 G, чтобы гранулировать яйца и аспирировать раствор M9.
Выполните промывку четыре раза, чтобы исключить любой отбеливатель из яичной смеси. После четвертой промывки центрифузии аспирируют раствор М9 от 100 микролитров до двух миллилитров в зависимости от общего количества отбеливаемых червей. Тщательно встряхните яйца, чтобы разбить комочки и убедиться, что яйца полностью повторно суспендированы в растворе M9.
Альтернативно, животные могут быть арестованы для более плотной временной синхронизации путем добавления от 10 до 12 миллилитров раствора M9 к грануле яйца в 15-миллилитровой летописной трубке. Позвольте червям вращаться в ротаторе до 24 часов при температуре 20 градусов по Цельсию. Для аппроксимации яйца или L одной концентрации пипетки четыре микролитра яичной смеси на пластину NGM, сидящую с бактериями.
Затем подсчитайте и рассчитайте яйца, присутствующие на микролитр среды. Повторите подсчет три или четыре раза, чтобы улучшить приближение, исходя из аппроксимационной пластины, соответствующего количества яиц или L одного арестованного животного на шнековой пластине NGM, засеянной бактериями по выбору. Измерить поведение локомотива червей с помощью трэшинга.
Переместите небольшое количество взрослых червей с шнековой пластины NGM на 10-20 микролитров раствора M9 под рассекающим прицелом. Затем сосредоточьтесь на одном черве за раз и подсчитайте, сколько раз образец переключается с вогнутого на выпуклое образование за 15 секунд. Используйте счетчик рук и таймер и повторите процедуру для 10-15 червей.
Старейте червей до желаемого возраста и повторяйте измерения во всех желаемых возрастах. Как визуализируется, старые черви мечутся со значительно более медленными скоростями. Для измерения количества и фертильности.
Из 10-15 червей Caenorhabditis elegans выделяют L четыре червя в отдельную шнековую пластину NGM, засеянную бактериями выбора. Дайте животным расти ночью при температуре 20 градусов по Цельсию и убедитесь, что недавно посеянная партия тарелок готова к следующему дню. Чтобы измерить количество яиц, отложенных Caenorhabditis elegans, переносят взрослых червей в свежую шнековую лопатку NGM, засеянную этими награбленными бактериями, каждые 12-24 часа в течение семи-восьми дней или до тех пор, пока яйца больше не будут видны, и подсчитайте количество яиц, отложенных на пластинах.
Чтобы измерить размер расплода Caenorhabditis elegans, переносите взрослых червей на свежую шнековую пластину NGM, засеянную бактериями каждые 12-24 часа, или семь-восемь дней, или до тех пор, пока потомство больше не будет видно. Держите все тарелки, содержащие яйца, при температуре 20 градусов по Цельсию. Через два дня после переноса глистов.
Подсчитайте развитое потомство на тарелке. Подсчитайте всех живых и развивающихся червей на стадии L four или ранее, чтобы убедиться, что F два поколения не путают результаты. Удалите всех червей с тарелки по мере их подсчета.
Поддерживайте пластины в течение дополнительного одного-двух дней, прежде чем забить их снова, чтобы гарантировать, что любые животные с задержкой вылупления или развития не будут пропущены. Влияние метода стерилизации на продолжительность жизни диких нематод типа N2 показало, что изменения в продолжительности жизни червей, выращенных на шнековых пластинах NGM, были аналогичны изменениям в продолжительности жизни червей, выращенных на пластинах шнека FDR NGM или мутантных животных glp four BN2, выращенных на шнековых пластинах NGM. Недолговечное животное HSF one knockdown показало значительное снижение продолжительности жизни при всех условиях.
Существенное снижение количества отложенных яиц и размера расплода было обнаружено у HSF над экспрессивными животными по сравнению с контролем дикого типа. Некоторые животные СНВ продемонстрировали полную стерильность, что указывает на то, что репродуктивное здоровье может быть обратно коррелировано с долголетием. Скорость метания обеспечила надежный метод измерения здоровья во время старения, измеряемый значительным снижением трэшинга у старых животных по сравнению с молодыми.
Выживаемость в стрессе является надежным анализом для измерения здоровья организма, туникамицин, который вызывает стресс ретикулума, привел к сокращению продолжительности жизни независимо от концентрации по сравнению с контролем ДМСО. Высокие уровни параквата значительно сократили продолжительность жизни, в то время как низкие концентрации параквата увеличили продолжительность жизни из-за горметического эффекта. В анализах термотолерантности повышенная экспрессия HSF один увеличила термодвижимость на 37 градусов Цельсия Для всех экспериментов по продолжительности жизни и старению.
Важно помнить, что методы стерилизации могут оказывать плейотропное воздействие на здоровье организма, что влияет на результаты. Существует множество дополнительных и дополнительных подходов к измерению продолжительности здоровья при наличии оборудования и инфраструктуры, включая измерения транскрипции, агрегации трансляционного белка, органелл, морфологии и метаболических функций.
