Questo protocollo presenta i metodi più economici e tecnologici più bassi per servire l'invecchiamento negli elegans marini. Un organismo modello influente nella biologia dell'invecchiamento. Il più grande vantaggio di questi metodi è la facilità di implementazione, utilizzando attrezzature e materiali a basso costo.
Rendendoli accessibili a qualsiasi ricercatore indipendentemente dall'esperienza o dai finanziamenti disponibili. Come vecchi studi sull'invecchiamento c'è una variabilità naturale nella salute all'interno delle popolazioni. Pertanto, è essenziale che gli esperimenti vengano eseguiti su animali sani, ben nutriti e strettamente sincronizzati.
Per garantire la disabilità dello strappo Iniziare la preparazione di un litro di terreno di crescita nematode o piastra a coclea NGM. Aggiungere 2,5 grammi di pep tone, 3,0 grammi di cloruro di sodio e 20 grammi di coclea in un pallone da un litro con una barra di mescolamento e aggiungere acqua distillata a un volume finale di 970 millilitri. Sterilizzare la soluzione a coclea NGM in un pallone da un litro utilizzando un'autoclave standard o uno sterilizzatore per supporti.
E lasciare che la soluzione si mescoli fino a quando non si raffredda a 60-75 gradi Celsius. Mentre la soluzione si raffredda, riscaldare un bagno di perline da 65 a 70 gradi Celsius. Una volta che la soluzione della coclea NGM si raffredda a 60-75 gradi Celsius.
Aggiungere gli additivi liquidi e lasciare che la soluzione si mescoli completamente per cinque minuti. Quindi immergere il pallone in un bagno di perline a 65-70 gradi Celsius per evitare che il supporto si solidifichi mentre si versa nella piastra. Pipettare da nove a 11 millilitri della soluzione in ciascuna piastra da 60 millilitri.
Al termine, riposizionare la pipetta nella soluzione riscaldata per mantenere la temperatura ed evitare che il fluido si solidifichi nella pipetta. Ripetere la procedura per tutte le piastre e lasciare che le piastre NGM a si solidifichino durante la notte. Una volta solidificati, usali per seminare piastre con batteri o conservare le piastre in contenitori sigillati per un massimo di tre mesi a quattro gradi Celsius per sincronizzare i vermi tramite sbiancamento.
Raccogliere i nematodi versando una piccola quantità di soluzione di M9 su una piastra contenente i vermi senza riempire eccessivamente la capsula di Petri. Quindi ruotare delicatamente la soluzione M nine per allentare i vermi dai prati batterici. Quindi, raccogliere vermi gravidi adulti in un tubo da 15 millilitri con una pipetta sierologica.
Evitare di forare la coclea con la punta della pipetta. Pellettare gli animali per centrare per 30 secondi a 1100 volte G e aspirare il surnatante. Aggiungere cinque millilitri della soluzione sbiancante appena preparata al pellet di verme e controllare i vermi al microscopio da dissezione ogni pochi minuti insieme a un vigoroso agitazione intermittente fino a quando tutti i corpi dei vermi adulti sono sciolti e solo le uova sono rimaste nel mix.
Quindi, pellettare le uova facendo girare la miscela di candeggina per 30 secondi a 1100 volte G e aspirare la soluzione sbiancante. Quindi lavare le uova pellettate aggiungendo fino a 15 millilitri di soluzione M9 e capovolgendo il tubo quattro o cinque volte per disperdere le uova e la soluzione. Anche in questo caso, centrifugare il tubo per 30 secondi a 1100 volte G per pellettare le uova e aspirare la soluzione M9.
Eseguire il lavaggio quattro volte per eliminare la candeggina dal mix di uova. Dopo il quarto lavaggio centrifusion aspirare la soluzione M9 da 100 microlitri a due millilitri a seconda del numero totale di vermi sbiancati. Agitare accuratamente le uova per rompere i grumi e assicurarsi che le uova siano completamente risospese nella soluzione M9.
In alternativa, gli animali possono essere arrestati per una sincronizzazione temporale più stretta aggiungendo da 10 a 12 millilitri di soluzione M9 al pellet di uova in un tubo cronico da 15 millilitri. Lascia che i vermi girino in un rotatore per un massimo di 24 ore a 20 gradi Celsius. Per approssimare l'uovo o L una concentrazione pipettare quattro microlitri della miscela di uova su una piastra NGM seduta con batteri.
Quindi contare e calcolare le uova presenti per microlitro di supporto. Ripetere il conteggio tre o quattro volte per migliorare l'approssimazione, in base alla piastra di approssimazione, il numero appropriato di uova o L uno animali arrestati sulla piastra della coclea NGM seminata con batteri di scelta. Per misurare il comportamento della locomotiva dei vermi tramite thrashing.
Spostare un piccolo numero di vermi adulti del primo giorno da una piastra a coclea NGM su 10-20 microlitri di soluzione M9 sotto un cannocchiale da dissezione. Quindi concentrati su un verme alla volta e conta il numero di volte in cui il campione passa da una formazione concava a una convessa in 15 secondi. Utilizzare un contatore manuale e un timer e ripetere la procedura per 10-15 vermi.
Invecchiare i vermi all'età desiderata e ripetere le misurazioni di thrashing a tutte le età desiderate. Come visualizzato, i vermi più vecchi si muovono a velocità significativamente più lente. Per misure di quantità e fertilità.
In 10-15 vermi Caenorhabditis elegans, individuano L quattro vermi in una piastra a coclea NGM separata seminata con batteri di scelta. Consentire agli animali di crescere durante la notte a 20 gradi Celsius e assicurarsi che un nuovo lotto di piatti seminato sia pronto per il giorno successivo. Per misurare la quantità di uova deposte da Caenorhabditis elegans trasferire i vermi adulti in una lama di coclea NGM fresca seminata con quei batteri saccheggiati ogni 12-24 ore per sette-otto giorni o fino a quando le uova non sono più visibili e contare il numero di uova deposte sui piatti.
Per misurare le dimensioni della covata di Caenorhabditis elegans Trasferire i vermi adulti su una piastra a coclea NGM fresca seminata con batteri ogni 12-24 ore, o da sette a otto giorni o fino a quando la progenie non è più visibile. Conservare tutti i piatti contenenti uova a 20 gradi Celsius. Due giorni dopo il trasferimento dei vermi.
Conta la progenie sviluppata sul piatto. Contare tutti i vermi vivi e in via di sviluppo allo stadio L quattro o prima per garantire che la generazione F due non confonda i risultati. Rimuovere tutti i vermi dal piatto man mano che vengono contati.
Mantenere le piastre per altri uno o due giorni prima di segnarle di nuovo per garantire che tutti gli animali con schiusa o sviluppo ritardati non vengano persi. L'effetto del metodo di sterilizzazione sulla durata della vita dei nematodi selvatici tipo N2 ha mostrato che i cambiamenti nella durata della vita dei vermi cresciuti sulle piastre della coclea NGM erano simili a quelli dei vermi cresciuti sulle piastre FUDR della coclea NGM o sui quattro animali mutanti BN2 GLP cresciuti sulle piastre della coclea NGM. L'animale da abbattimento HSF di breve durata ha mostrato un calo significativo della durata della vita per tutte le condizioni.
Una sostanziale diminuzione del numero di uova deposte e delle dimensioni della covata è stata riscontrata negli animali HSF rispetto ai controlli di tipo selvatico. Alcuni animali HSF hanno mostrato una completa sterilità indicando che la salute riproduttiva può essere inversamente correlata alla longevità. Il tasso di thrashing ha fornito un metodo affidabile per misurare la salute durante l'invecchiamento, misurato da una significativa diminuzione del thrashing negli animali anziani rispetto a quelli giovani.
La sopravvivenza allo stress sono test affidabili per misurare la salute dell'organismo, la tunicamicina che causa lo stress del reticolo ha comportato una riduzione della durata della vita indipendentemente dalla concentrazione rispetto al controllo DMSO. Gli alti livelli di paraquat hanno notevolmente ridotto la durata della vita, mentre basse concentrazioni di paraquat hanno aumentato la durata della vita a causa dell'effetto ormetico. Nei saggi di tolleranza termica, la sovraespressione di HSF ha aumentato la tolleranza termica a 37 gradi Celsius per tutti gli esperimenti di durata della vita e invecchiamento.
È importante ricordare che le tecniche di sterilizzazione possono avere un effetto pleiotropico sulla salute dell'organismo, che influisce sui risultati. Esistono molti approcci aggiuntivi e complementari per misurare la durata della salute se sono disponibili attrezzature e infrastrutture, comprese le misurazioni della trascrizione, l'aggregazione delle proteine di traduzione, l'organello, la morfologia e le funzioni metaboliche.
