يصف هذا البروتوكول طريقة تدريجية لوضع العلامات الإشعاعية للخلايا والزركونيوم 89-DBN وتتبعه غير الجراحي بواسطة PET. توفر هذه التقنية أيضا طريقة موثوقة ومستقرة لوضع العلامات الإشعاعية على الخلايا عن طريق الاقتران التساهمي للزركونيوم 89-DBN إلى الوسائل الأساسية لبروتينات سطح الخلية. سيجد الأطباء والعلماء الذين يعملون مع العلاجات الخلوية للأمراض العصبية وأنواع السرطان المختلفة أن هذا البروتوكول مفيد في فهم الحرائك الدوائية للعلاجات القائمة على الخلايا عبر التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني غير الجراحي.
يوفر البروتوكول التفصيلي إرشادات للمستخدمين الجدد لتعلم واعتماد تقنية وضع العلامات الإشعاعية هذه. ستساعد العقد الإضافية المضمنة في الخطوات الهامة في استكشاف المشكلات وإصلاحها لمستخدم جديد. للبدء ، قم بإعداد عمود يحتوي على حوالي 100 ملليغرام من راتنج الهيدروكسيمات ، وقم بتنشيطه عن طريق غسل العمود بثمانية ملليلتر من الأسيتونيتريل اللامائي النقي متبوعا بتدفق من خمسة إلى ستة ملليلتر من الهواء.
مرر ملليلتر من 0.5 حمض الهيدروكلوريك الطبيعي إلى العمود. بعد تمرير تدفق إضافي من خمسة إلى ستة ملليلتر من الهواء ، قم بتحميل المحلول الذي يحتوي على كل من الزركونيوم 89 والإيتريوم الطبيعي إلى راتنج الهيدروكسيمات ببطء. اغسل الإيتريوم الطبيعي غير المنضم من راتنج الهيدروكسيمات ب 20 مل من اثنين من حمض الهيدروكلوريك الطبيعي ، متبوعا ب 10 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات.
لتفادي الزركونيوم في شكل فوسفات هيدروجين زركونيوم 89 ، أضف 0.5 ملليلتر من 1.2 مولار ثنائي فوسفات البوتاسيوم فوسفات فوسفات هيدروجين البوتاسيوم إلى العمود واتركه يجلس على العمود لمدة 30 دقيقة. أضف 1.5 ملليلتر إضافية من المخزن المؤقت 1.2 المولي لإزالة الزركونيوم من العمود. بعد ذلك ، خذ حوالي 120 ميكرولتر من فوسفات الهيدروجين الزركونيوم -89 المركب في المخزن المؤقت وقم بتحييد المحلول باستخدام HEPES-KOH وكربونات البوتاسيوم لتحقيق درجة حموضة 7.528.
أضف أربعة ميكرولترات من خمسة مليمولات DFO-Bn-NCS المحضرة حديثا إلى حوالي 285 ميكرولتر من فوسفات الهيدروجين الزركونيوم 89 المعادل. وخلط الحل عن طريق ماصة. بعد عزل الزركونيوم من الإيتريوم ، أضف 0.5 ملليلتر من حمض الأكساليك المولي إلى العمود واتركه يجلس على العمود لمدة دقيقة واحدة لإزالة الزركونيوم في شكل أكسالات الزركونيوم 89.
أضف 2.5 ملليلتر إضافية من حمض الأكساليك المولي إلى العمود. لتحويل أكسالات الزركونيوم 89 إلى كلوريد الزركونيوم 89 ، اغسل عمود تبادل الأنيون بستة ملليلتر من الأسيتونيتريل ، متبوعا بتدفق من خمسة إلى ستة ملليلتر من الهواء. ثم اغسل العمود ب 10 ملليلتر من المحلول الملحي متبوعا بتدفق آخر من الهواء.
ببطء ، قم بتحميل المحلول الذي يحتوي على أكسالات الزركونيوم 89 على عمود تبادل الأنيون المنشط قبل إعادة غسله بالهواء. بعد ذلك ، اغسل العمود ب 50 ملليلترا من الماء منزوع الأيونات لإزالة أيون الأكسالات غير المرتبط. لمراوغة الزركونيوم في صورة كلوريد الزركونيوم 89 ، أضف 0.1 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك العادي إلى العمود واتركه يجلس على العمود لمدة دقيقة واحدة.
تخلص من الزركونيوم من العمود ب 0.4 ملليلتر إضافي من حمض الهيدروكلوريك الطبيعي الواحد. جفف كلوريد الزركونيوم 89 المستعصي عليه في قنينة على شكل حرف V عن طريق وضعه في كتلة تسخين عند 65 درجة مئوية تحت تدفق مستمر لغاز النيتروجين لمدة 10 إلى 30 دقيقة ، ثم أعد تكوين كلوريد الزركونيوم 89 المجفف في الماء. قم بإعداد 500 ميكرولتر من تعليق الخلايا مع ما يقرب من 6 ملايين خلية في 500 ميكرولتر من HBSS المخزن HEPES في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر وإضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر من الزركونيوم 89-DBN المصاغ.
امزج الزركونيوم 89-DBN وتعليق الخلية عن طريق سحب المحلول برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة صغيرة. احتضان الخلايا وخليط الزركونيوم 89-DBN على شاكر عند حوالي 550 دورة في الدقيقة عند 25 إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة لوضع العلامات على الخلايا. قم بإجراء TLC المشع على تفاعل الملصقات الإشعاعية للخلية باستخدام مذيب TLC المشع الطازج.
احسب النسبة المئوية للنشاط الإشعاعي عند التردد اللاسلكي تساوي 0.01 إلى 0.02 باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة. في أنبوب طرد مركزي صغير منفصل سعة 1.5 ملليلتر ، امزج حوالي 100 ميكرولتر من الزركونيوم 89-DBN المركب مع حوالي 500 ميكرولتر من HBSS المخزن مؤقتا HEPES لاستخدامه كعنصر تحكم بدون خلية لتصحيح الخلفية. احسب النسبة المئوية للنشاط الإشعاعي عند التردد اللاسلكي تساوي 0.01 إلى 0.02 باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة ، ثم احسب الوسم الإشعاعي الفعال للخلية بطرح النسبتين المئويتين المحسوبتين للنشاط الإشعاعي.
بعد التأكد من الانتهاء من وضع العلامات الإشعاعية ، أضف 600 ميكرولتر من الوسط الكامل المناسب للخلية المبردة لإجراء إخماد تفاعل الملصقات الإشعاعية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 96G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. وتجاهل الطاف.
أعد تعليق الخلايا المحببة برفق في 500 ميكرولتر من الوسط المبرد عن طريق سحب الوسط لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة صغيرة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 96G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتجاهل طاف المياه. بعد ذلك ، احسب كفاءة وضع العلامات الإشعاعية النهائية بعد كل عمليات الغسل باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة.
لضمان جودة الخلايا ذات العلامات الإشعاعية ، افحص بصريا التعليق النهائي للخلايا ذات العلامات المشعة ، وإذا لم تكن هناك كتل ، فقم بإجراء اختبار صلاحية استبعاد التريبان الأزرق باستخدام محلول تريبان الأزرق 0.4٪ المحضر في برنامج تلفزيوني في غضون ساعة واحدة من وضع العلامات الإشعاعية وخطوات الغسيل. تختلف كفاءة الاستخلاب ل DFO-Bn-NCS للزركونيوم -89 باستخدام فوسفات الهيدروجين الزركونيوم -89 وكلوريد الزركونيوم -89 كما تم قياسها بواسطة TLC المشع. يوضح هنا استقرار الخلايا المختلفة الموسومة إشعاعيا بالزركونيوم-89 على مدار سبعة أيام.
وجد أن الاحتفاظ بالنشاط الإشعاعي للزركونيوم -89 بواسطة الخلايا الموسومة إشعاعيا مستقر في جميع الخلايا التي تمت دراستها ، مع تدفق ضئيل لوحظ على مدى سبعة أيام بعد وضع العلامات. يوضح هذا الجدول كفاءات وضع العلامات الإشعاعية للخلايا في أنواع مختلفة من الخلايا باستخدام الزركونيوم 89-DBN. تتراوح كفاءة وضع العلامات الإشعاعية للخلية من 20 إلى 50٪ كعائد غير مصحح لوحظ في حبيبات الخلية ذات العلامات الإشعاعية بعد الغسيل.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي إضافة DFO-Bn-NCS إلى خليط الاستخلاب وتقييم جودة الخلايا المشعة. سيساعد تطبيق هذه التقنية على فهم الحرائك الدوائية للعلاجات القائمة على الخلايا. كما أنه سيثير تساؤلات حول أي حاجة سريرية لتغيير ملف تعريف إزالة العلاجات الخلوية.
