이 프로토콜은 세포 및 지르코늄-89-DBN의 방사선 표지 및 PET에 의한 비침습적 추적을 위한 단계적 방법을 설명합니다. 이 기술은 또한 지르코늄-89-DBN을 세포 표면 단백질의 주요 수단에 공유 결합하여 세포를 방사성 표지하기 위한 신뢰할 수 있고 안정적인 방법을 제공합니다. 신경 질환 및 다양한 암에 대한 세포 요법을 연구하는 의사와 과학자는 이 프로토콜이 비침습적 PET 이미징을 통해 세포 기반 요법의 약동학을 이해하는 데 도움이 된다는 것을 알게 될 것입니다.
상세 프로토콜은 새로운 사용자가 이 방사성 표지 기법을 배우고 채택할 수 있도록 지침을 제공합니다. 중요 단계에 포함된 추가 노드는 새 사용자의 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다. 시작하려면 약 100mg의 하이드록사메이트 수지로 컬럼을 준비하고 8밀리리터의 순수 무수 아세토니트릴로 컬럼을 세척한 후 5-6밀리리터의 공기로 세척하여 컬럼을 활성화합니다.
0.5 일반 염산 2 밀리리터를 컬럼에 통과시킵니다. 5-6 밀리리터의 공기를 추가로 세척한 후 지르코늄-89와 천연 이트륨을 모두 함유한 용액을 하이드록사메이트 수지에 천천히 로드합니다. 하이드록사메이트 수지에서 결합되지 않은 천연 이트륨을 20밀리리터의 두 개의 일반 염산으로 세척한 다음 10밀리리터의 탈이온수를 세척합니다.
지르코늄-89 인산수소 형태의 지르코늄을 제거하려면 1.2몰 디포타슘 포스페이트 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 완충액 0.5mL를 컬럼에 추가하고 컬럼 위에 30분 동안 그대로 둡니다. 1.5mL의 1.2몰 버퍼를 추가하여 컬럼에서 지르코늄을 용리합니다. 다음으로, 완충액에 제형화된 약 120마이크로리터의 지르코늄-89 인산수소를 취하고 HEPES-KOH 및 탄산칼륨으로 용액을 중화하여 pH 7.528을 달성합니다.
약 285마이크로리터의 중화된 지르코늄-89 인산수소에 갓 준비한 5밀리몰 DFO-Bn-NCS 4마이크로리터를 추가합니다. 그리고 피펫팅으로 용액을 혼합합니다. 이트륨에서 지르코늄을 분리한 후 컬럼에 1몰 옥살산 0.5mL를 추가하고 컬럼에 1분 동안 그대로 두어 지르코늄-89 옥살레이트 형태로 지르코늄을 용리합니다.
컬럼에 2.5mL의 1몰 옥살산을 추가합니다. 지르코늄-89 옥살레이트를 지르코늄-89 클로라이드로 전환하려면 음이온 교환 컬럼을 6밀리리터의 아세토니트릴로 세척한 다음 5-6밀리리터의 공기로 세척합니다. 그런 다음 10mL의 식염수로 컬럼을 세척한 다음 다시 공기를 씻어냅니다.
지르코늄-89 옥살레이트가 함유된 용액을 공기로 다시 세척하기 전에 활성화된 음이온 교환 컬럼에 천천히 로드합니다. 그런 다음 50ml의 탈이온수로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 옥살산염 이온을 제거합니다. 지르코늄-89 클로라이드 형태의 지르코늄을 피하려면 0.1ml의 일반 염산을 컬럼에 추가하고 1분 동안 컬럼에 그대로 두십시오.
컬럼에서 지르코늄을 0.4 밀리리터의 일반 염산으로 용출합니다. 제거된 지르코늄-89 염화물을 V자형 바이알에 넣고 섭씨 65도의 가열 블록에 넣어 10-30분 동안 질소 가스가 일정하게 흐르도록 한 다음 건조된 지르코늄-89 염화물을 물에서 재구성합니다. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 500마이크로리터의 HEPES 완충 HBSS에 약 600만 개의 셀이 포함된 500마이크로리터의 셀 현탁액을 준비하고 약 100마이크로리터의 제형화된 지르코늄-89-DBN을 추가합니다.
마이크로 피펫으로 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 지르코늄-89-DBN과 셀 현탁액을 혼합합니다. 세포 라벨링을 위해 약 550 RPM의 셰이커에서 25-37 섭씨 온도에서 30-45 분 동안 세포와 지르코늄-89-DBN 혼합물을 배양합니다. 갓 준비한 방사성 TLC 용매를 사용하여 세포 방사성 표지 반응에서 방사성 TLC를 수행합니다.
화면에 표시된 방정식을 사용하여 0.01에서 0.02에 해당하는 Rf에서 방사능의 백분율을 계산합니다. 별도의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에서 약 100마이크로리터의 제형화된 지르코늄-89-DBN과 약 500마이크로리터의 HEPES 완충 HBSS를 혼합하여 배경 보정을 위한 노셀 컨트롤로 사용합니다. 화면에 표시된 방정식을 사용하여 0.01에서 0.02에 해당하는 Rf에서의 방사능 백분율을 계산한 다음 계산된 두 개의 방사능 백분율을 빼서 유효 세포 방사능 표지를 계산합니다.
방사성 표지 완료를 확인한 후, 600 마이크로리터의 냉각된 셀에 적합한 완전한 배지를 첨가하여 방사성 표지 반응의 담금질을 수행합니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 96G에서 세포를 원심분리합니다. 그리고 상층액을 버리십시오.
마이크로 피펫으로 배지를 위아래로 피펫팅하여 펠릿화된 세포를 500마이크로리터의 냉각된 매체에 부드럽게 재현탁시킵니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 96G에서 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다. 다음으로, 화면에 표시된 방정식을 사용하여 모든 세척 후 최종 방사선 표지 효율을 계산합니다.
방사성 표지 세포의 품질을 보장하기 위해 방사성 표지 세포의 최종 현탁액을 육안으로 검사하고, 덩어리가 없는 경우 방사성 표지 및 세척 단계 후 1시간 이내에 PBS에서 준비한 0.4% 트리판 블루 용액을 사용하여 트리판 블루 배제 생존도 테스트를 수행합니다. 지르코늄-89 인산수소와 지르코늄-89 염화물을 사용하는 지르코늄-89에 대한 DFO-Bn-NCS의 킬레이트화 효율은 방사성 TLC로 측정한 것과 다릅니다. 7일 동안 지르코늄-89로 방사성 표지된 다양한 세포의 안정성이 여기에 나와 있습니다.
방사성 표지된 세포에 의한 지르코늄-89 방사능의 잔류는 연구된 모든 세포에서 안정적인 것으로 나타났으며, 표지 후 7일 동안 관찰된 유출은 무시할 수 있는 수준이었습니다. 지르코늄-89-DBN을 사용하는 다양한 세포 유형에서의 세포 방사성 표지 효율이 이 표에 나와 있습니다. 세포 방사성 표지 효율은 세척 후 방사성 표지된 세포 펠릿에서 관찰되는 보정되지 않은 수율로 20%에서 50%까지 다양합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 킬레이트 혼합물에 DFO-Bn-NCS를 추가하고 방사성 표지 세포의 품질을 평가하는 것입니다. 이 기술의 적용은 세포 기반 치료법의 약동학을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 또한 세포 치료제의 클리어런스 프로파일을 변경해야 할 임상적 필요성에 대한 질문도 제기될 수 있습니다.
