Bu protokol, hücrelerin ve zirkonyum-89-DBN'nin radyoaktif etiketlenmesi ve PET ile non-invaziv takibi için aşamalı bir yöntemi açıklar. Bu teknik aynı zamanda, zirkonyum-89-DBN'nin hücre yüzey proteinlerinin birincil araçlarına kovalent konjugasyonu ile hücrelerin radyoaktif etiketlenmesi için güvenilir ve kararlı bir yöntem sağlar. Nörolojik hastalıklar ve çeşitli kanserler için hücre tedavileri ile çalışan doktorlar ve bilim adamları, bu protokolü, invaziv olmayan PET görüntüleme yoluyla hücre bazlı tedavilerin farmakokinetiğini anlamada etkili bulacaktır.
Ayrıntılı protokol, yeni kullanıcılara bu radyoetiketleme tekniğini öğrenmeleri ve benimsemeleri için rehberlik sağlar. Kritik adımlarda yer alan ek düğümler, yeni bir kullanıcı için sorunların giderilmesine yardımcı olacaktır. Başlamak için, yaklaşık 100 miligram hidroksamat reçinesi içeren bir kolon hazırlayın ve kolonunu sekiz mililitre saf susuz asetonitril ile yıkayarak ve ardından beş ila altı mililitre hava ile yıkayarak etkinleştirin.
Kolona iki mililitre 0.5 normal hidroklorik asit geçirin. Beş ila altı mililitre hava ek bir yıkamadan geçtikten sonra, hem zirkonyum-89 hem de doğal itriyum içeren çözeltiyi yavaşça hidroksimat reçinesine yükleyin. Bağlanmamış doğal itriyumun hidroksamat reçinesinden 20 mililitre iki normal hidroklorik asit, ardından 10 mililitre deiyonize su ile yıkanması.
Zirkonyumdan zirkonyum-89 hidrojen fosfat formunda kurtulmak için, kolona 0.5 mililitre 1.2 molar dipotasyum fosfat potasyum dihidrojen fosfat tamponu ekleyin ve kolon üzerinde 30 dakika bekletin. Zirkonyumu kolondan çıkarmak için 1.5 mililitre 1.2 molar tampon ekleyin. Daha sonra, tamponda formüle edilmiş yaklaşık 120 mikrolitre zirkonyum-89 hidrojen fosfat alın ve 7.528'lik bir pH elde etmek için çözeltiyi HEPES-KOH ve potasyum karbonat ile nötralize edin.
Yaklaşık 285 mikrolitre nötralize zirkonyum-89 hidrojen fosfata dört mikrolitre taze hazırlanmış beş milimolar DFO-Bn-NCS ekleyin. Ve çözeltiyi pipetleyerek karıştırın. Zirkonyumu itriyumdan izole ettikten sonra, kolona 0.5 mililitre bir molar oksalik asit ekleyin ve zirkonyumu zirkonyum-89 oksalat formunda elüte etmek için kolon üzerinde bir dakika bekletin.
Kolona 2.5 mililitre bir molar oksalik asit ekleyin. Zirkonyum-89 oksalatı zirkonyum-89 klorüre dönüştürmek için, anyon değişim kolonunu altı mililitre asetonitril ile yıkayın, ardından beş ila altı mililitre hava ile yıkayın. Ardından, sütunu 10 mililitre tuzlu su ile yıkayın ve ardından başka bir hava yıkayın.
Zirkonyum-89 oksalat içeren çözeltiyi hava ile tekrar yıkamadan önce aktif anyon değişim kolonuna yavaşça yükleyin. Ardından, bağlanmamış oksalat iyonunu çıkarmak için sütunu 50 mililitre deiyonize su ile yıkayın. Zirkonyumdan zirkonyum-89 klorür formunda kurtulmak için, kolona 0.1 mililitre normal bir hidroklorik asit ekleyin ve kolonda bir dakika bekletin.
Zirkonyumu kolondan 0.4 mililitre ilave bir normal hidroklorik asit ile çıkarın. Çıkarılan zirkonyum-89 klorürü, 10 ila 30 dakika boyunca sabit bir nitrojen gazı akışı altında 65 santigrat derecede bir ısıtma bloğuna yerleştirerek V şeklinde bir şişede kurutun ve ardından kurutulmuş zirkonyum-89 klorürü suda yeniden sulandırın. 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde 500 mikrolitre HEPES tamponlu HBSS'de yaklaşık 6 milyon hücre ile 500 mikrolitre hücre süspansiyonu hazırlayın ve formüle edilmiş zirkonyum-89-DBN'den yaklaşık 100 mikrolitre ekleyin.
Zirkonyum-89-DBN ve hücre süspansiyonunu, çözeltiyi bir mikro pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Hücreleri ve zirkonyum-89-DBN karışımını, hücre etiketlemesi için 30 ila 45 dakika boyunca 25 ila 37 santigrat derecede yaklaşık 550 RPM'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Yeni hazırlanmış radyoaktif TLC çözücü kullanarak hücre radyoaktif işaretleme reaksiyonu üzerinde radyoaktif TLC gerçekleştirin.
Ekranda gösterilen denklemi kullanarak Rf'deki radyoaktivite yüzdesini 0.01 ila 0.02'ye eşit olarak hesaplayın. Ayrı bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde, arka plan düzeltmesi için hücresiz bir kontrol olarak kullanmak için yaklaşık 100 mikrolitre formüle edilmiş zirkonyum-89-DBN'yi yaklaşık 500 mikrolitre HEPES tamponlu HBSS ile karıştırın. Ekranda gösterilen denklemi kullanarak Rf'deki radyoaktivite yüzdesini 0,01 ila 0,02'ye eşit olarak hesaplayın, ardından hesaplanan iki radyoaktivite yüzdesini çıkararak etkili hücre radyoetiketlemesini hesaplayın.
Radyo-etiketlemenin tamamlandığını onayladıktan sonra, radyo-etiketleme reaksiyonunun söndürülmesini gerçekleştirmek için 600 mikrolitre soğutulmuş hücreye uygun tam ortam ekleyin. Hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 96G'de santrifüjleyin. Ve süpernatanı atın.
Peletlenmiş hücreleri, soğutulmuş ortamın 500 mikrolitresinde, ortamı bir mikro pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri 96G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, ekranda gösterilen denklemi kullanarak tüm yıkamalardan sonra nihai radyoetiketleme verimliliğini hesaplayın.
Radyoaktif işaretli hücrelerin kalitesinden emin olmak için, radyoaktif işaretli hücrelerin son süspansiyonunu görsel olarak inceleyin ve herhangi bir küme yoksa, radyoaktif etiketleme ve yıkama adımlarından sonraki bir saat içinde PBS'de hazırlanan% 0.4 tripan mavisi çözeltisi kullanarak bir tripan mavisi dışlama canlılık testi yapın. Zirkonyum-89 hidrojen fosfat ve zirkonyum-89 klorür kullanılarak zirkonyum-89 için DFO-Bn-NCS'nin şelasyon verimliliği, radyoaktif TLC ile ölçüldüğü gibi farklıdır. Yedi gün boyunca zirkonyum-89 ile radyoaktif işaretli çeşitli hücrelerin stabilitesi burada gösterilmektedir.
Zirkonyum-89 radyoaktivitesinin radyoaktif işaretli hücreler tarafından tutulmasının, incelenen tüm hücrelerde stabil olduğu ve etiketlemeden sonraki yedi gün boyunca ihmal edilebilir bir akış gözlendiği bulundu. Zirkonyum-89-DBN ile farklı hücre tiplerindeki hücre radyoaktif etiketleme verimlilikleri bu tabloda gösterilmektedir. Hücre radyo-etiketleme verimliliği, yıkamadan sonra radyoaktif işaretli hücre peletinde gözlenen düzeltilmemiş bir verim olarak %20 ila %50 arasında değişmektedir.
Bu protokolün en kritik adımı, şelasyon karışımına DFO-Bn-NCS eklenmesi ve radyoaktif işaretli hücrelerin kalite değerlendirmesidir. Bu tekniğin uygulanması, hücre bazlı tedavilerin farmakokinetiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Ayrıca, hücre tedavilerinin klirens profilini değiştirmek için herhangi bir klinik ihtiyaç hakkında sorular ortaya çıkaracaktır.
