هذا بروتوكول قياسي لمعالجة وتخزين عينات الدم لتطبيقات الخزعة السائلة في المصب على أساس تعميم الحمض النووي الحر. هذا هو أول بروتوكول قياسي يتم نشره ، على الرغم من أن هذه التقنية كانت قيد الاستخدام لعدة سنوات. من السهل اتباعها مع المعدات القياسية المتوفرة في معظم المختبرات الانتقالية أو العلمية.
ويمكن لجميع موظفي المختبر تنفيذ البروتوكول. يساعد البروتوكول على توحيد كيفية جمع العينات وتخزينها ، مما سيؤثر في النهاية في العيادة ويقلل من التباين بين المراكز المختلفة التي تجري نفس التحليل النهائي أو ما شابهه حيث تكون الدقة ذات أهمية قصوى. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في أبحاث الأورام وأيضا في التطبيقات السريرية.
ومع ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا في أمراض أخرى غير سرطانية حيث يتم استخدام الخزعة السائلة أيضا. بعد أن يتم طرد عينة الدم مركزيا ، قد يكون من الصعب معرفة كمية البلازما أو المصل المطلوب إزالتها ، ولكن اتباع هذه الإرشادات المحددة سيساعد في ذلك. من السهل جدا اتباع بقية البروتوكول مع خبرة محدودة في المختبر.
سيوضح الإجراء خورخي ، وهو فني من مختبرنا. للبدء ، قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على دم طازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1600 مرة غرام ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر. قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
ستظهر المرحلة العليا من supernatant المصل واضحة ومصفرة. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم وسجل وجود انحلال الدم عند الاقتضاء. في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية ، انقل المصل إلى أنابيب التجميع كأليكوتات سعة 250 ميكرولتر.
يجب تسمية الأليكوتات بشكل صحيح. قم بتجميد المصل على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وسجل وقت تخزين العينة. تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ أربع ساعات.
قم بطرد مركزي لأنبوب EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1600 مرة جم ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر. بعد الطرد المركزي ، سيظهر السوبرنات البلازما واضحا ومصفرا. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم ونقل البلازما إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر دون إزعاج الطبقة الخلوية باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها.
اترك كمية صغيرة متبقية من البلازما فوق طبقة الخلية عند حوالي خمسة ملليمترات. إذا لوحظ انحلال الدم ، فتجاهل العينة لمزيد من التحليل. جهاز طرد مركزي للبلازما وأنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر لإزالة أي خلايا دم سليمة متبقية تم نقلها من خطوة الطرد المركزي الأولى.
قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ، وليس بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب ، وانقل واحدا إلى أربعة ملليلترات من البلازما إلى واحد إلى أربعة ملليلتر من البولي بروبيلين المبرد أو Eppendorfs باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها. يجب ترك الحجم المتبقي من البلازما في أسفل الأنبوب لتجنب تلويث البلازما بخلايا الدم. قم بتجميد البلازما على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وسجل وقت تخزين العينة.
تحقق من أن العينات قد تم تصنيفها بشكل صحيح وتمت معالجتها خلال الإطار الزمني المطلوب لمدة أربع ساعات. جمع الطبقة الخلوية باستخدام P1000 وطرف مصفى ونقلها إلى أنبوب 2 ملليلتر. تجمد على الفور وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.
يظهر هنا مثال على استخراج cfDNA عالي الجودة الذي يمكن استخدامه في التطبيقات النهائية ، في حين تمثل هذه الصورة الرسومية مثالا على عينة غير مناسبة ذات مستوى عال من التلوث الجينومي. يجب أن يكون جزء البلازما أو المصل أصفر اللون. قد يختلف هذا اعتمادا على العينة الفردية.
يجب التخلص من العينات المصابة بانحلال الدم. احرص على عدم إزالة أي حبيبات خلية عند إزالة جزء البلازما. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول في تطبيقات أخرى قائمة على الأحماض النووية والبروتينات ، مثل الكشف عن الحمض النووي الريبي غير المشفر أو البروتينات في عينات المصل والبلازما باستخدام تقنيات الكشف المناعي.
هذه تقنية قياسية للغاية تستخدم في العديد من المختبرات. يساعد هذا البروتوكول الباحثين على توحيد كيفية إجراء تحليلنا لأن هذا جانب حاسم وضروري للتطبيقات السريرية المستقبلية.
