Este es un protocolo estándar para el procesamiento y almacenamiento de muestras de sangre para aplicaciones de biopsia líquida aguas abajo basadas en ADN libre circulante. Este es el primer protocolo estándar publicado, aunque la técnica ha estado en uso durante varios años. Es fácil de seguir con el equipo estándar disponible en la mayoría de los laboratorios traslacionales o científicos.
El protocolo puede ser realizado por todo el personal del laboratorio. El protocolo ayuda a estandarizar la forma en que recolectamos y almacenamos muestras, lo que en última instancia tendrá un impacto en la clínica y reducirá la variabilidad entre los diferentes centros que realizan el mismo o similar análisis posterior donde la precisión es de suma importancia. Este método es particularmente útil en la investigación oncológica y también en aplicaciones clínicas.
Sin embargo, también se puede aplicar en otras enfermedades no cancerosas donde también se usa la biopsia líquida. Después de que la muestra de sangre se haya centrifugado, saber cuánto plasma o suero eliminar puede ser difícil, pero seguir estas pautas específicas ayudará con esto. El resto del protocolo es muy fácil de seguir con experiencia limitada en el laboratorio.
Demostrando el procedimiento estará Jorge, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar, centrifugar el tubo que contiene sangre fresca a temperatura ambiente durante 10 minutos a 1600 veces g, con la ruptura máxima aplicada. Retire con cuidado el tubo de la centrífuga.
La fase superior del sobrenadante sérico aparecerá clara y amarillenta. Compruebe si la muestra muestra signos de hemólisis y registre la presencia de hemólisis cuando corresponda. En un gabinete de bioseguridad de Clase II, transfiera el suero a tubos de recolección como alícuotas de 250 microlitros.
Las alícuotas deben estar correctamente etiquetadas. Congele inmediatamente el suero en posición vertical en la caja de almacenamiento a menos 80 grados centígrados y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de cuatro horas.
Centrifugar el tubo EDTA a temperatura ambiente durante 10 minutos a 1600 veces g, con la rotura máxima aplicada. Después de la centrifugación, el sobrenadante plasmático aparecerá claro y amarillento. Compruebe si la muestra muestra signos de hemólisis y transfiera el plasma a un tubo de centrífuga de 15 mililitros sin alterar la capa celular utilizando una pipeta serológica desechable.
Deje un pequeño volumen residual de plasma por encima de la capa celular a aproximadamente cinco milímetros. Si se observa hemólisis, deseche la muestra para su posterior análisis. Centrifugar el plasma y un tubo de centrífuga de 15 mililitros para eliminar cualquier célula sanguínea intacta residual arrastrada desde el primer paso de centrifugación.
Retire con cuidado el tubo de la centrífuga, no el pellet celular en el fondo del tubo, y transfiera de uno a cuatro mililitros de plasma a uno a cuatro mililitros de bios criogénicos de polipropileno o Eppendorfs usando una pipeta serológica desechable. Se debe dejar un volumen residual de plasma en la parte inferior del tubo para evitar contaminar el plasma con células sanguíneas. Congele inmediatamente el plasma en posición vertical en la caja de almacenamiento a menos 80 grados centígrados y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra.
Verifique que las muestras estén correctamente etiquetadas y se procesaron dentro del plazo requerido de cuatro horas. Recoja la capa celular usando un P1000 y una punta filtrada y transfiérala a un tubo de dos mililitros. Congele inmediatamente y almacene a menos 80 grados centígrados.
Aquí se muestra un ejemplo de una extracción de cfDNA de alta calidad que se puede utilizar para aplicaciones posteriores, mientras que esta imagen gráfica representa un ejemplo de una muestra inadecuada con un alto nivel de contaminación genómica. La fracción plasmática o sérica debe ser de color amarillo. Esto puede variar dependiendo de la muestra individual.
Las muestras con hemólisis deben descartarse. Tenga cuidado de no eliminar ningún pellet celular al extraer la fracción plasmática. Este protocolo también se puede utilizar para otras aplicaciones basadas en ácidos nucleicos y proteínas, como la detección de ARN o proteínas no codificantes en muestras de suero y plasma utilizando técnicas de inmunodetección.
Esta es una técnica muy estándar utilizada en muchos laboratorios. Este protocolo ayuda a los investigadores a estandarizar cómo realizamos nuestros análisis, ya que este es un aspecto crucial, necesario para futuras aplicaciones clínicas.
