تعد فحوصات التقاط وتمديد الحلقة D هي الأولى التي تسمح بالقياس الكمي غير المتحيز والمباشر لتشكيل الحلقة D وخطوات التمديد أثناء إعادة التركيب المتماثل في خلايا الخميرة التي تنمو بشكل انقسامي. تسمح هذه التقنية المستقلة عن الجدوى بدراسة البروتينات في استقلاب D-loop التي لن يكون من الممكن فصلها عن الأدوار اللاحقة ، بمجرد النظر إلى منتجات BIR. في المستقبل ، نتصور نقل هذه المقايسات إلى خلايا بشرية لفهم دور البروتينات الرئيسية بشكل أفضل ، بما في ذلك BRCA2 وحالات بلوم ووارنر كيلو في إعادة التركيب المتماثل.
ابدأ بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 2.5 ملليلتر من محلول 1x psoralen وانقلها إلى طبق بتري 60 × 15 ملم. لعدم وجود عنصر تحكم في الربط المتشابك، أعد تعليق الحبيبات في 2.5 ملليلتر من محلول TE1.
بعد ذلك ، اضبط مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية في الجزء العلوي في شاكر مداري ، تم ضبطه على 50 دورة في الدقيقة. لربط العينات باستخدام رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية مع لمبات موجة طويلة 365 نانومتر. ضع أطباق بتري على بعد سنتيمتر إلى سنتيمترين تحت مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق مع رجها برفق على طبق بلاستيكي أو زجاج شبكي مبرد مسبقا.
ثم نقل العينة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. اشطف طبق بتري ب 2.5 ملليلتر من محلول TE1 وأضفه إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة خمس دقائق.
تخلص من المادة الطافية وقم بتخزين الحبيبات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. ضع العينات على الثلج للذوبان. في وقت واحد ، سخن حمام جاف إلى 30 درجة مئوية.
أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للسفع الكروي وانقلها إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 3.5 ميكرولتر من محلول zymolyase واخلطه بلطف عن طريق النقر. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ثم ضع الأنابيب على الجليد. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق ووضع العينات على الجليد. اغسل العينات ثلاث مرات في محلول تفجير كروي واحد ملليلتر وجهاز طرد مركزي للعينات لمدة ثلاث دقائق.
أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من محلول إنزيم تقييد البارد. جهاز طرد مركزي لمدة ثلاث دقائق ووضع العينات على الجليد. كرر الغسيل مرة واحدة.
أعد تعليق العينات في ملليلتر واحد من محلول إنزيم تقييد بارد 1x. قسم العينة بالتساوي إلى قسمين. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة ثلاث دقائق عند 16،000 G عند أربع درجات مئوية.
أعد تعليق أنبوب واحد من كل عينة في 180 ميكرولتر من محلول إنزيم التقييد 1.4x مع تهجين oligos وأنبوب آخر في 180 ميكرولتر من محلول إنزيم التقييد 1.4x دون تهجين oligos. التقط تجميد العينات في النيتروجين السائل. قم بإذابة العينات على الجليد.
سخن حماما جافا إلى 65 والآخر إلى 37 درجة مئوية. حصة 36 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي صغير جديد وأربعة ميكرولتر من 1٪ SDS وتخلط عن طريق النقر برفق على جانب الأنبوب. احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع النقر اللطيف كل خمس دقائق.
ضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة. أضف 4.5 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 واخلطها عن طريق السحب. أضف 20 إلى 50 وحدة من إنزيم تقييد EcoR1 أو HindIII عالي الدقة إلى كل عينة.
واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع التقليب اللطيف كل 20 إلى 30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، حمام جاف مسخن إلى 55 درجة مئوية وحمام مائي إلى 16 درجة مئوية. أضف 8.6 ميكرولتر من 10٪ SDS إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب والتنصت.
احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 80 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب. أضف 660 ميكرولترا من 1x مخزن ربط مؤقت بدون ATP ، و ATP واحد مليمولار عند الرقم الهيدروجيني 8.0 وثماني وحدات من T4 DNA ligase لكل عينة ، واخلطها برفق عن طريق الانقلاب.
احتضان 16 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة مع انعكاس كل 30 دقيقة. ضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة. بعد تنقية الحمض النووي كما هو موضح في البروتوكول ، استخدم ميكرولترين من الحمض النووي المنقى لإعداد تفاعل qPCR سعة 20 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
لكل عينة ، قم بإعداد خمسة تفاعلات تحكم وتفاعل قياس كمي واحد وقم بتشغيلها في نسختين. أظهر تحليل مقايسة DLC بعد ساعتين من كسر مزدوج تقطعت بهم السبل أو تحريض DSB أن الربط المتقاطع للسورالين أمر بالغ الأهمية وأن الكفاءة تعتمد على الوقت بين جمع العينات و qPCR. كانت قيم ARG4 Cp متشابهة بين العينات المتشابكة ولكنها أقل بالنسبة للعينة التي لا تحتوي على روابط متقاطعة لأن الحمض النووي بدون روابط متقاطعة يتضخم بشكل أكثر كفاءة.
بالنسبة لجميع العينات ، كان التحكم في qPCR للربط بين الجزيئات ضمن النطاق. تم إثبات تحريض DSB القوي من خلال إشارة qPCR منخفضة للتحكم الذي يتضخم عبر موقع التعرف على نوكلياز HO endonuclease. لوحظت نتائج مماثلة للتحكم في EcoR1 qPCR.
تم حساب إشارة DLC مع تهجين oligo عن طريق التطبيع إلى التحكم في الربط بين الجزيئات. أظهر تحليل مقايسة DLE الذي تم إجراؤه بعد ست ساعات من تحريض DSB أن قيم ARG4 CP كانت متشابهة بين عينة oligos المهرجة وبدونها. كشف التحكم qPCR في الربط بين الجزيئات عن إشارة مقبولة لعينة oligos مع وبدون تهجين ولكن إشارة أقل للعينة الفاشلة.
في جميع العينات الثلاث ، كان هناك تحريض قوي ل DSB. نظرا لأن انشقاق HindIII يعتمد على استعادة موقع إنزيم التقييد بواسطة oligo المهجن. كان هناك اختلاف كبير في التضخيم عبر موقع انشقاق HindIII على الشريط المقطوع بين العرض وبدون عينات oligo.
لوحظ اختلاف أصغر في التضخيم عبر الموقع على الشريط الممتد لأن الانقسام HindIII هنا يعتمد أيضا على الامتداد. يجب أن تبقى العينات والمخزن المؤقت باردة في جميع الأوقات. يجب تجميد العينات تلقائيا بعد إعادة التعليق في محلول إنزيم تقييد بارد 1.4x مع أو بدون تهجين oligos.
يمكن دراسة التأثيرات النهائية لتشكيل الحلقة D وتمديدها على تكوين المنتج باستخدام النشاف الجنوبي أو مقايسات نقطة النهاية الجينية. يمكن التحقيق في التأثيرات على البحث التماثلي باستخدام CP العالي. يمكن أن يوفر الترسيب المناعي للكروماتين معلومات حول تجنيد بروتين مهم.
