D-loop捕捉および伸長アッセイは、有糸分裂増殖酵母細胞における相同組換え中のD-ループ形成および伸長ステップの偏りのない直接定量を可能にする最初のものです。この生存率に依存しない技術により、BIR製品を見るだけでは、他の方法では後の役割から解きほぐすことが不可能なDループ代謝におけるタンパク質の研究が可能になります。将来的には、これらのアッセイをヒト細胞に移行して、BRCA2やブルームおよびワーナーキロのケースを含む主要なタンパク質が相同組換えにおける役割をよりよく理解することを想定しています。
サンプルを5分間遠心分離することから始めます。ペレットを2.5ミリリットルの1xソラレン溶液に再懸濁し、60 x 15ミリメートルのペトリ皿に移します。架橋制御を行わない場合は、ペレットを2.5ミリリットルのTE1溶液に再懸濁します。
次に、UV光源をオービタルシェーカーの上部に設定し、50RPMに設定します。365ナノメートルの長波電球を備えたUV架橋剤を使用してサンプルを架橋する。ペトリ皿をUV光源の1〜2センチメートル下に10分間置き、事前に冷やしたプラスチックまたはプレキシガラスプレートで静かに振とうします。
次に、サンプルを新しい15ミリリットルのチューブに移します。ペトリ皿を2.5ミリリットルのTE1溶液ですすぎ、これをチューブに加えます。サンプルを5分間遠心分離します。
上清を廃棄し、マイナス20°Cでペレットを保管します。解凍のためにサンプルを氷の上に置きます。同時に、乾式浴を摂氏30度に予熱します。
サンプルを1ミリリットルのスフェロプラストバッファーに再懸濁し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。次に、3.5マイクロリットルのザイモリアーゼ溶液を加え、軽くたたいて穏やかに混ぜます。摂氏30度で15分間インキュベートします。
そして、チューブを氷の上に置きます。3分間遠心分離し、サンプルを氷上に置きます。サンプルを1ミリリットルのスフェロプラストバッファーで3回洗浄し、サンプルを3分間遠心分離します。
サンプルを1ミリリットルの低温制限酵素バッファーに再懸濁します。3分間遠心分離し、サンプルを氷上に置きます。洗浄を一度繰り返します。
サンプルを1ミリリットルの冷たい1x制限酵素バッファーに再懸濁します。サンプルを均等に 2 つに分割します。摂氏4度で16, 000 Gで3分間サンプルを遠心分離します。
各サンプルの1本のチューブをハイブリダイズオリゴを含む180マイクロリットルの1.4倍制限酵素バッファーに再懸濁し、もう1本のチューブをハイブリダイズオリゴを含まない180マイクロリットルの1.4倍制限酵素バッファーに再懸濁します。液体窒素でサンプルをスナップ凍結します。サンプルを氷上で解凍します。
1つの乾浴を65度に、もう1つを摂氏37度に予熱します。36マイクロリットルのサンプルを新しいマイクロ遠心チューブと4マイクロリットルの1%SDSに分注し、チューブの側面を軽くたたいて混合します。摂氏65度で15分間インキュベートし、5分ごとに軽くたたきます。
インキュベーション直後にサンプルを氷上に置きます。4.5マイクロリットルの10%Triton X-100を加え、ピペッティングで混合する。各サンプルに20〜50単位のハイフィデリティEcoR1またはHindIII制限酵素を追加します。
そして、摂氏37度で1時間インキュベートし、20〜30分ごとに穏やかに攪拌します。この間、乾浴を摂氏55度に予熱し、水浴を摂氏16度に予熱した。各サンプルに8.6マイクロリットルの10%SDSを加え、ピペッティングとタッピングで混合します。
摂氏55度で10分間インキュベートします。各サンプルに80マイクロリットルの10%Triton X-100を加え、ピペッティングで混合します。各サンプルにATPを含まない1xライゲーションバッファー660マイクロリットル、pH 8.0で1ミリモルATP、および8単位のT4 DNAリガーゼを加え、転位により穏やかに混合します。
摂氏16度で1.5時間インキュベートし、30分ごとに反転させます。インキュベーション直後にサンプルを氷上に置きます。プロトコルに記載されているDNA精製に続いて、2マイクロリットルの精製DNAを使用して、製造元の指示に従って20マイクロリットルのqPCR反応を設定します。
サンプルごとに、5つのコントロール反応と1つの定量反応を設定し、それらを二重に実行します。二本鎖切断またはDSB誘導の2時間後のDLCアッセイ分析では、ソラレン架橋が重要であり、効率はサンプル収集とqPCRの間の時間に依存することが示されました。ARG4 Cp値は架橋サンプル間で類似していたが、架橋のないDNAはより効率的に増幅するため、架橋なしサンプルでは低かった。
全てのサンプルについて、分子間ライゲーションqPCRコントロールは前記範囲内であった。堅牢なDSB誘導は、HOエンドヌクレアーゼ認識部位全体で増幅するコントロールの低qPCRシグナルによって証明されました。EcoR1 qPCRコントロールについても同様の結果が観察されました。
ハイブリダイズオリゴを有するDLCシグナルは、分子間ライゲーションコントロールに正規化することにより算出した。DSB誘導後6時間で実施されたDLEアッセイ分析は、ARG4 CP値がハイブリダイズオリゴサンプルありとなしの間で類似していることを示しました。分子間ライゲーションqPCRコントロールでは、ハイブリダイズオリゴサンプルの有無にかかわらず許容可能なシグナルが明らかになりましたが、失敗したサンプルではより低いシグナルが明らかになりました。
3つのサンプルすべてで、堅牢なDSB誘導がありました。HindIII切断はハイブリダイズオリゴによる制限酵素部位回復に依存するからである。切除された鎖のHindIII切断部位の増幅は、幅とオリゴなしのサンプルの間で有意差がありました。
伸長鎖上の部位全体の増幅のより小さな差が観察されたのは、ここでHindIII切断も伸長に依存するためである。サンプルとバッファーは常に冷たく保つ必要があります。サンプルは、ハイブリダイズオリゴの有無にかかわらず、1.4倍の低温制限酵素バッファーに再懸濁した後、瞬間凍結する必要があります。
Dループ形成および伸長の下流が生成物形成に及ぼす影響は、サザンブロッティングまたは遺伝的エンドポイントアッセイを用いて研究することができる。相同性検索に対する効果は、高CPを用いて調べることができる。クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質の動員に関する情報を提供することができます。
