ملف تعريف SEC هو وسيلة قوية لتحليل جودة البروتين. الهدف هو جمع ملف تعريف SEC لبروتين الغشاء باستخدام مضان ، والذي يمكن أن يبلغ عن جودة العينة. يستخدم FSEC كميات صغيرة من العينات ويمكن إجراؤه للتنقية ، وهو بسيط نسبيا ، ويمكن تنفيذه على المعدات المتوفرة في العديد من المختبرات.
سيوضح الإجراء جاك رايت ، كبير علماء البروتين من Peak Proteins. ابدأ بتحضير لوحات الخلايا عن طريق إذابة لوحة الخلايا المخزنة في درجة حرارة الغرفة تحت الصفر عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، أو حتى تختفي العينة مجمدة. انقل العينة على الفور إلى الثلج.
لإعادة تعليق العينة وإذابتها ، أضف ملليلتر من المخزن المؤقت للذوبان إلى لوحة الخلية. احتضان مع انعكاس طرف إلى طرف عند أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ثم أضف مرق المنظفات المخلوط مسبقا لعمل تركيز نهائي قدره 1٪ دوديسيل مالتوسيد ، أو DDM ، و 0.1٪ كوليسترول هيميسوكسينات ، أو CHS.
يذوب لمدة 30 دقيقة مع انعكاس طرف إلى طرف عند أربع درجات مئوية. لأداء خطوة طرد مركزي منخفضة السرعة ، قم بطرد العينة في جهاز طرد مركزي على الطاولة باستخدام دلو متأرجح للخارج وأجهزة طرد مركزي عند 2000 جرام لمدة 15 دقيقة. ثم قم بإجراء الطرد المركزي عالي السرعة عن طريق نقل المادة الطافية من جهاز الطرد المركزي منخفض السرعة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائقة باستخدام إبرة حادة متصلة بحقنة سعة خمسة ملليلترات.
تأكد من عدم إزعاج اللوحة. بعد موازنة أزواج الأنابيب ، ضعها في دوار طرد مركزي فائق الزاوية وجهاز طرد مركزي بزاوية ثابتة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 250،000 جرام. قم بإعداد كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع ، أو نظام FPLC عن طريق ملء النظام بالكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أو المخزن المؤقت SEC ، وتطهير مضخات الهواء.
قم بتوصيل عمود SEC ب FPLC ، مما يضمن عدم دخول الهواء إلى العمود. قم بموازنة عمود SEC مسبقا عن طريق غسله في أحجام أعمدة 1.5 مرة من الماء المقطر والمصفى من الدرجة المختبرية ، متبوعا بأحجام أعمدة 1.5 مرة من المخزن المؤقت SEC بمعدل التدفق والضغط الموصى بهما للعمود. لتشغيل تجربة SEC ، انقل المادة الطافية من خطوة الطرد المركزي عالية السرعة إلى حقنة سعة ملليلتر واحد باستخدام إبرة حادة متصلة بالمحقنة.
اضبط حلقة العينة على التحميل. قم بملء حلقة عينة سعة 500 ميكرولتر عن طريق حقن 600 إلى 700 ميكرولتر من العينة من المحقنة في منفذ التحميل. بعد ذلك ، قم بحقن العينة من الحلقة في العمود عن طريق إفراغها بأربعة ملليلتر من المخزن المؤقت SEC بمعدل التدفق والضغط الموصى بهما.
قم بتشغيل العمود بنفس معدل التدفق حتى مرور 1.5 ضعف حجم المخزن المؤقت ، وابدأ في جمع 90 كسرا من 0.2 ملليلتر بعد تمرير 0.25 ضعف حجم العمود. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 90 ميكرولترا من الماء المقطر من الدرجة المختبرية من خزان إلى كل بئر من صفيحة معتمة مسطحة القاع ذات 96 بئرا. ثم انقل 10 ميكرولترات من العينات من صفيحة 96 بئرا إلى لوحة معتمة ، مسطحة القاع ، 96 بئرا ، وضع لوحة البئر في قارئ الصفيحة.
بالنسبة إلى GFP المسمى بالفلورسنت ، et الإثارة أقرب ما يمكن إلى 488 نانومتر واكتشاف انبعاث الفلورسنت في أقرب وقت ممكن من 507 نانومتر قبل قياس الإشارة. أشار التحقيق في النطاق الديناميكي والحدود الدنيا للبروتين الفلوري الأخضر المحسن ، أو اكتشاف EGFP لقارئ اللوحة ، إلى أن قارئ اللوحة لديه حد كشف أقل يبلغ 30 نانوجرام ونطاق ديناميكي يصل إلى 500 نانوجرام من البروتين المسمى EGFP لكل بئر قبل تشبع الإشارة. سمح تحويل أحجام الشطف إلى Kav ورسمها مقابل الأوزان الجزيئية اللوغاريتمية بتقدير الوزن الجزيئي للمستقبلات المقترنة بالبروتين G عن طريق استيفاء المنحنى القياسي.
تم استكشاف ظروف استخراج الغشاء المثلى من خلال اختبار DDM و lauryl maltose neopentyl glycol ضد الاستخراج الخالي من المنظفات باستخدام كوبوليمر حمض الماليك الستايرين. تم فحص تأثير إضافة الربيطة على ملف كروماتوغرافيا استبعاد حجم التألق عن طريق إضافة سفينغوسين-1-فوسفات ، أو S1P ، إلى العينة أثناء الذوبان. أظهرت العينة القابلة للذوبان في وجود S1P أثرا فائقا مع تجميع منخفض.
أشار التحقيق في الاستقرار طويل الأجل لمستقبلات السيروتونين 5HT2AR في ظل ظروف مختلفة إلى أن البروتين الموجود في جزيئات دهون حمض المالئيك الستايرين ظل مستقرا لفترة أطول ، حتى في درجات الحرارة غير المواتية. الوقت بين نقطة الذوبان والعينة التي تمر أسفل عمود SEC حرج للوقت. يجب ألا يكون هناك توقف مؤقت ، ويجب أن تبقى العينة باردة.
بعد FSEC ، سيتم اكتساب فهم لأفضل بنية أو منظف أو مخزن مؤقت. وهذا يسمح بتحسين تنقية البروتين ويدعم التوصيف البيوفيزيائي والهيكلي النهائي.
