Um perfil SEC é uma maneira poderosa de analisar a qualidade de uma proteína. O objetivo é coletar um perfil de SEC para uma proteína de membrana usando fluorescência, que pode informar sobre a qualidade da amostra. O FSEC utiliza pequenas quantidades de amostra e pode ser realizado para purificação, é relativamente simples e pode ser realizado em equipamentos disponíveis em muitos laboratórios.
Quem demonstrará o procedimento será Jack Wright, cientista sênior de proteínas da Peak Proteins. Comece pela preparação das paletas de células descongelando a paleta de células armazenada a 80 graus Celsius negativos à temperatura ambiente durante 15 minutos, ou até que a amostra deixe de estar congelada. Mova a amostra imediatamente para o gelo.
Para ressuspender e solubilizar a amostra, adicione dois mililitros do tampão de solubilização à paleta celular. Incubar com inversão end-over-end a quatro graus Celsius por 15 a 30 minutos. Em seguida, adicione caldo de detergente pré-misturado para fazer uma concentração final de 1% de dodecil maltosídeo, ou DDM, e 0,1% de colesterol hemisuccinato, ou CHS.
Solubilizar por 30 minutos com inversão término-sobre-fim a quatro graus Celsius. Para realizar uma etapa de centrifugação de baixa velocidade, centrifugar a amostra em uma centrífuga de bancada usando um balde oscilante e centrífuga a 2000g por 15 minutos. Em seguida, execute a centrifugação de alta velocidade transferindo o sobrenadante da centrifugação de baixa velocidade para tubos de ultracentrifugação usando uma agulha romba conectada a uma seringa de cinco mililitros.
Certifique-se de não perturbar a paleta. Depois de equilibrar os pares de tubos, coloque-os em um rotor de ultracentrifugação de ângulo fixo e centrífugo a quatro graus Celsius por 30 minutos a 250.000g. Prepare a cromatografia líquida de proteína rápida, ou sistema FPLC, enchendo o sistema com cromatografia de exclusão de tamanho, ou tampão SEC, e purgando as bombas de ar.
Conecte a coluna SEC ao FPLC, garantindo que nenhum ar entre na coluna. Pré-equilibre a coluna SEC lavando-a em 1,5 vezes os volumes da coluna de água destilada e filtrada de grau laboratorial, seguidos por 1,5 vezes os volumes da coluna de tampão SEC na taxa de fluxo e pressão recomendadas para a coluna. Para executar o experimento SEC, transfira o sobrenadante da etapa de centrifugação de alta velocidade para uma seringa de um mililitro usando uma agulha romba conectada à seringa.
Defina o loop de amostra para carregar. Transborde um circuito de amostra de 500 microlitros injetando de 600 a 700 microlitros da amostra da seringa na porta de carregamento. Em seguida, injete a amostra do laço na coluna esvaziando-a com quatro mililitros de tampão SEC na vazão e pressão recomendadas.
Execute a coluna na mesma taxa de fluxo até a passagem de 1,5 vezes o volume do buffer e comece a coletar 90 frações de 0,2 mililitros após passar de 0,25 vezes o volume da coluna. Usando uma pipeta multicanal, transfira 90 microlitros de água destilada de laboratório de um reservatório para cada poço de uma placa opaca, de fundo plano e 96 poços. Em seguida, transfira os 10 microlitros das amostras de uma placa de 96 poços para a placa opaca, de fundo plano, de 96 poços, e coloque a placa de poço em um leitor de placas.
Para a GFP marcada com fluorescência, a excitação é o mais próxima possível de 488 nanômetros e detecta a emissão fluorescente o mais próximo possível de 507 nanômetros antes de medir o sinal. A investigação da faixa dinâmica e dos limites inferiores da proteína fluorescente verde aprimorada, ou detecção de EGFP para o leitor de placas, indicou que o leitor de placas tinha um limite de detecção inferior de 30 nanogramas e um intervalo dinâmico de até 500 nanogramas de proteína marcada com EGFP por poço antes da saturação do sinal. A conversão dos volumes de eluição em Kav e sua plotagem contra pesos moleculares logarítmicos permitiu estimar o peso molecular dos receptores acoplados à proteína G por interpolação da curva padrão.
As condições ótimas de extração por membrana foram exploradas testando-se o DDM e a laurilmaltose neopentilglicol contra a extração livre de detergente com copolímero de ácido maleico de estireno. O efeito da adição de ligantes no perfil cromatográfico de exclusão de tamanho de fluorescência foi investigado pela adição de esfingosina-1-fosfato, ou S1P, à amostra durante a solubilização. A amostra solubilizada na presença de S1P apresentou traço superior com agregação reduzida.
A investigação da estabilidade a longo prazo do receptor de serotonina 5HT2AR sob diferentes condições indicou que a proteína presente nas partículas lipídicas do ácido maleico estireno permaneceu estável por mais tempo, mesmo em temperaturas desfavoráveis. O tempo entre o ponto de solubilização e a passagem da amostra pela coluna SEC é crítico em termos de tempo. Não deve haver pausas e a amostra deve ser mantida fria.
Após o FSEC, uma compreensão do melhor construto, detergente ou buffer será obtida. Isso permite que a purificação de proteínas seja otimizada e suporta a caracterização biofísica e estrutural a jusante.
