Профиль SEC — это мощный способ анализа качества белка. Цель состоит в том, чтобы собрать профиль SEC для мембранного белка с использованием флуоресценции, который может информировать о качестве образца. FSEC использует небольшое количество образца и может быть проведена для очистки, относительно проста и может проводиться на оборудовании, имеющемся во многих лабораториях.
Продемонстрирует процедуру Джек Райт, старший ученый по белкам из Peak Proteins. Начните с подготовки ячеек, разморозив ячеечную палитру, хранящуюся при температуре минус 80 градусов Цельсия при комнатной температуре, в течение 15 минут или до тех пор, пока образец не перестанет быть замороженным. Немедленно переместите образец на лед.
Чтобы повторно суспендировать и растворить образец, добавьте два миллилитра буфера солюбилизации в палитру клеток. Инкубировать со сквозной инверсией при четырех градусах Цельсия в течение 15-30 минут. Затем добавьте предварительно смешанный моющий состав, чтобы получить конечную концентрацию 1% додецилмальтозида, или DDM, и 0,1% гемисукцината холестерина, или CHS.
Солюбилизируйте в течение 30 минут с сквозной инверсией при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить этап низкоскоростного центрифугирования, центрифугируйте образец в настольной центрифуге с помощью поворотного ведра и центрифуги при 2000 г в течение 15 минут. Затем выполняют высокоскоростное центрифугирование, перенося надосадочную жидкость из низкоскоростного центрифугирования в ультрацентрифугирующие пробирки с помощью иглы с тупым концом, прикрепленной к пятимиллилитровому шприцу.
Следите за тем, чтобы не нарушить палитру. После балансировки пар пробирок поместите их в ультрацентрифугирующий ротор с фиксированным углом и центрифугу при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут при 250 000 г. Подготовьте быструю белковую жидкостную хроматографию или систему FPLC, заполнив систему экспозиционной хроматографией или буфером SEC и продув насосы воздуха.
Подключите колонку SEC к FPLC, чтобы воздух не попадал в колонну. Предварительно уравновесьте колонну SEC, промыв ее в 1,5-кратном объеме лабораторной дистиллированной и фильтрованной воды, а затем в 1,5-кратном объеме буфера SEC при рекомендуемом расходе и давлении для колонны. Чтобы провести эксперимент SEC, перенесите надосадочную жидкость со стадии высокоскоростного центрифугирования в шприц объемом один миллилитр с помощью иглы с тупым концом, прикрепленной к шприцу.
Установите цикл выборки на загрузку. Переполните петлю для отбора проб объемом 500 микролитров, впрыснув от 600 до 700 микролитров образца из шприца в загрузочное отверстие. Затем введите образец из контура в колонну, опорожнив ее четырьмя миллилитрами буфера SEC при рекомендуемой скорости потока и давлении.
Запустите колонну с той же скоростью потока, пока объем буфера не увеличится в 1,5 раза, и начните собирать 90 фракций по 0,2 миллилитра после прохождения в 0,25 раза больше объема колонны. С помощью многоканальной пипетки передайте 90 микролитров лабораторной дистиллированной воды из резервуара в каждую лунку непрозрачной плоскодонной 96-луночной пластины. Затем перенесите 10 микролитров образцов с 96-луночной пластины на непрозрачную пластину с плоским дном на 96-луночную пластину и поместите луночную пластину в планшетный считыватель.
Для GFP с флуоресцентной меткой et возбуждение как можно ближе к 488 нанометрам и обнаружить флуоресцентное излучение как можно ближе к 507 нанометрам перед измерением сигнала. Исследование динамического диапазона и нижних пределов усиленного зеленого флуоресцентного белка или обнаружения EGFP для считывателя пластин показало, что считыватель планшетов имел нижний предел обнаружения 30 нанограммов и динамический диапазон до 500 нанограммов белка, меченного EGFP, на задолго до насыщения сигнала. Преобразование объемов элюирования в Kav и построение графика его по логарифмическим молекулярным массам позволило оценить молекулярную массу рецепторов, связанных с G-белком, путем интерполяции стандартной кривой.
Оптимальные условия мембранной экстракции были исследованы путем тестирования неопентилгликоля DDM и лаурилмальтозы против экстракции без моющих средств сополимером малеиновой кислоты стирола. Влияние добавления лиганда на профиль флуоресцентной эксклюзионной хроматографии исследовали путем добавления сфингозин-1-фосфата, или S1P, к образцу во время солюбилизации. Образец, солюбилизированный в присутствии S1P, показал превосходный след с уменьшенной агрегацией.
Исследование долговременной стабильности серотонинового рецептора 5HT2AR в различных условиях показало, что белок в липидных частицах малеиновой кислоты стирола дольше оставался стабильным даже при неблагоприятных температурах. Время между точкой растворения и прохождением образца вниз по столбцу SEC является критическим по времени. Пауз быть не должно, а образец должен храниться в холоде.
После FSEC будет получено представление о наилучшей конструкции, моющем средстве или буфере. Это позволяет оптимизировать очистку белка и поддерживает последующую биофизическую и структурную характеристику.
