通过荧光体积排阻色谱快速评估膜蛋白质量

SEC谱图是分析蛋白质质量的有效方法。目标是使用荧光收集膜蛋白的SEC谱，这可以告知样品质量。FSEC使用少量样品，可以进行纯化，相对简单，可以在许多实验室可用的设备上进行。

演示该程序的将是Peak Proteins的高级蛋白质科学家Jack Wright。首先通过解冻室温下储存在零下80摄氏度的细胞调色板15分钟来制备细胞调色板，或直到样品不再冷冻。立即将样品移至冰上。

要重新悬浮并溶解样品，请将两毫升增溶缓冲液添加到细胞调色板中。在 4 摄氏度下端到端倒置孵育 15 至 30 分钟。然后加入预混合的洗涤剂原料，使最终浓度为1%十二烷基麦芽糖苷（DDM）和0.1%胆固醇琥珀酸半胱氨酸（CHS）。

在 4 摄氏度下用端到端倒置溶解 30 分钟。要执行低速离心步骤，请使用外摆式桶在台式离心机中离心样品，并以 2000g 离心 15 分钟。然后使用连接到五毫升注射器的钝头将上清液从低速离心转移到超速离心管中进行高速离心。

确保不要打扰调色板。平衡成对的试管后，将它们放入固定角度的超速离心转子中，并在4摄氏度下以250， 000g离心30分钟。通过向系统填充体积排阻色谱或SEC缓冲液并吹扫空气泵来制备快速蛋白液相色谱或FPLC系统。

将SEC色谱柱连接到FPLC，确保没有空气进入色谱柱。通过在1.5倍柱体积的实验室级蒸馏和过滤水中洗涤SEC色谱柱，然后以1.5倍体积的SEC缓冲液以推荐的色谱柱流速和压力洗涤SEC色谱柱，对SEC色谱柱进行预平衡。为了运行SEC实验，使用连接到注射器的钝头将上清液从高速离心步骤转移到一毫升注射器中。

将示例循环设置为加载。通过将 600 至 700 微升样品从注射器注入装载口，将 500 微升样品环溢出。接下来，用四毫升SEC缓冲液以推荐的流速和压力将其清空，将样品从环中注入色谱柱。

以相同的流速运行色谱柱，直到通过缓冲液体积的1.5倍，并在通过0.25倍色谱柱体积后开始收集90个0.2毫升馏分。使用多通道移液器，将 90 微升实验室级蒸馏水从储液器转移到不透明、平底、96 孔板的每个孔中。然后将 10 微升样品从 96 孔板转移到不透明的平底 96 孔板中，并将孔板放入读板器中。

对于荧光标记的GFP，在测量信号之前，激发尽可能接近488纳米，并检测尽可能接近507纳米的荧光发射。对增强绿色荧光蛋白的动态范围和下限的研究，或酶标仪的EGFP检测表明，在信号饱和之前，酶标仪的检测下限为30 ng，动态范围高达每孔500 ng的EGFP标记蛋白。将洗脱体积转换为Kav并将其与对数分子量作图，可以通过标准曲线的插值来估计G蛋白偶联受体的分子量。

通过测试DDM和月桂基麦芽糖新戊二醇与苯乙烯马来酸共聚物无洗涤剂萃取的对比，探讨了最佳的膜提取条件。通过在增溶过程中向样品中添加鞘氨醇-1-磷酸或S1P来研究配体添加对荧光体积排阻色谱图的影响。在S1P存在下溶解的样品显示出更好的痕量，聚集减少。

对5-羟色胺受体5HT2AR在不同条件下的长期稳定性的研究表明，苯乙烯马来酸脂质颗粒中的蛋白质即使在不利的温度下也能保持更长时间的稳定。从溶解点到样品通过SEC色谱柱之间的时间是时间关键型的。不能停顿，样品必须保持低温。

在FSEC之后，将了解最佳结构，洗涤剂或缓冲液。这样可以优化蛋白质纯化，并支持下游生物物理和结构表征。