يسمح هذا البروتوكول بتحديد وعزل أسلاف الكريات الحمر BFU-E و CFU-E مباشرة من أنسجة الفئران التي تم حصادها حديثا مثل نخاع العظام والطحال. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا عزل مجموعات نقية من أسلاف الإريثرويد ، وهو ما لم يكن ممكنا مع بروتوكولات التدفق السابقة. تعزز هذه الطريقة بشكل كبير قدرتنا على دراسة نماذج فأر مرض الإريثرويد من خلال السماح بعزل السلف للعديد من التجارب النهائية.
للبدء ، ضع عظم الفخذ والساق الذي تم تشريحه حديثا مباشرة في مخزن تلطيخ بارد أو SB-5 واحتفظ بالأنابيب على الثلج حتى تصبح جاهزة لاستخراج نخاع العظام. ضع ملاطا معقم نظيفا على الثلج في دلو وانقل العظام إلى الهاون. باستخدام مقص التشريح ، قم بقص نهايات 1 ملليمتر تقريبا من كل عظم.
استخدم حقنة سعة 3 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 26 تحتوي على SB-5 لطرد النخاع من العظام وتجميعه في الهاون وكرر العملية من 3 إلى 5 مرات باستخدام مخزن مؤقت جديد في كل مرة حتى تظهر العظام عديمة اللون. قم بتصفية النخاع المتدفق من خلال شبكة 100 ميكرومتر وجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يوضع على الثلج. بعد ذلك ، استخدم الهاون والمدقة لسحق العظام المتدفقة في 5 إلى 10 ملليلتر من SB-5.
قم بتصفية خليط العظام المسحوقة والعازلة من خلال مصفاة الخلايا 100 ميكرومتر لتجميعها مع الخلايا التي تم جمعها مسبقا. قم بإعداد مرشح شبكي 100 ميكرومتر على أنبوب طرد مركزي فارغ سعة 50 ملليلتر يوضع على الجليد. ضع طحالا واحدا على مرشح الشبكة وأضف 0.5 إلى 1 ملليلتر من SB-5 إلى الطحال لضمان عدم جفافه.
باستخدام الجانب المطاطي من مكبس حقنة 3 أو 5 ملليلتر ، اهرس الطحال من خلال الشبكة. أضف المزيد من SB-5 ، 5 ملليلتر في المرة الواحدة ، واستمر في الهرس حتى يتم جمع جميع الخلايا في الأنبوب. قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب الخلايا المجمعة لأعلى ولأسفل باستخدام 2 ملليلتر من SB-5 باستخدام طرف فتحة كبير.
قم بتلطيخ مضان ناقص واحد أو ضوابط FMO عن طريق إضافة جميع الأجسام المضادة باستثناء الجسم المضاد الذي يحمل الاسم نفسه ل FMO إلى تعليق الخلية في أنبوب FACS. لتلطيخ عناصر التحكم أحادية اللون ، أضف جسما مضادا واحدا إلى معلق الخلية في أنبوب FACS. دوامة كل أنبوب تحكم لمدة 2 إلى 3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة ثم احتضان عند 4 درجات مئوية هزاز لمدة 2.5 ساعة في الظلام.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام SB-5 وقم بتكوين حجم تعليق الخلية إلى 4 ملليلتر مع SB-5. قم بتدوير الخلايا عند 900 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية واستنشاق المادة الطافية. أعد تعليق عناصر التحكم غير الملوثة وجميع عناصر التحكم أحادية اللون في 300 ميكرولتر من SB-5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنابيب FACS الجديدة.
اصنع حل DAPI SB-5 عن طريق تخفيف مخزون DAPI بنسبة 1 إلى 10،000 في SB-5. أعد تعليق FMOS في 1.8 ملليلتر من DAPI SB-5 والتحكم أحادي اللون DAPI في 300 ميكرولتر من DAPI SB-5 ، ثم قم بترشيحها من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنابيب FACS جديدة. بعد إضافة مزيج الأجسام المضادة الرئيسي إلى كل عينة ، دوامة الأنابيب لمدة 2 إلى 3 ثوان عند 3000 دورة في الدقيقة تليها الحضانة عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 2.5 ساعة في حالة هزاز.
بعد غسل الخلايا كما هو موضح سابقا ، أعد تعليق العينات في 1.8 ملليلتر من DAPI SB-5 وقم بالتصفية من خلال شبكة مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS جديد وتحليل العينات باستخدام مقياس المثانة. استخدم التشتت الأمامي لإزالة الحطام بناء على الحجم، ثم استخدم الرسم البياني لارتفاع التشتت الأمامي مقابل الرسم البياني لمنطقة التشتت الأمامي لاستبعاد مجاميع الخلايا وتحديد الخلايا المفردة. كرر الاستبعاد مع الرسم البياني لارتفاع التشتت الجانبي مقابل الرسم البياني لمنطقة التشتت الجانبي.
استبعاد الخلايا الميتة عن طريق إخراج الخلايا الإيجابية ل DAPI. حدد النسب سلبي TUR واحد 19 خلية إيجابية مجموعة سلبية. ومن هذه حدد مجموعة سكانية فرعية تعبر عن CD 55.
قسم النسب السالب TUR واحد 19 ، مجموعة سالبة ، إيجابية ، CD 55 خلايا موجبة إلى 2 مجموعات أساسية ، P ستة و P سبعة بناء على التعبير عن CD 49 F و CD 1 0 5. الآن استنادا إلى التعبير عن CD 150 و CD 41 ، قسم P 6 إلى P 3 و P 4 و P 5. وبالمثل ، بناء على تعبير CD 150 و CD 71 ، قم بتقسيم P 7 إلى BFUE و CFUE المبكر و CFUE المتأخر.
في هذه الدراسة ، تم تحديد وحدات تشكيل الانفجار والمستعمرة من خلايا نخاع العظم والطحال التي تم حصادها حديثا. بعد 72 ساعة من الإريثروبويتين ، أو حقن السيارة في الفئران ، أظهر تحفيز الإريثروبويتين توسعا في مجموعات وحدة تشكيل المستعمرة المبكرة والمتأخرة P 1 منخفضة و P 1 عالية في خلايا نخاع العظم والطحال المحصودة. كما أظهرت استجابة أسلاف نخاع العظم والطحال للإريثروبويتين في الجسم الحي عددا أكبر من الخلايا في مجموعات الوحدات المكونة للمستعمرة المبكرة والمتأخرة P 1 منخفضة و P 1 عالية ، مقارنة بالتحكم في السيارة.
من المهم للغاية إنشاء تعليق خلية واحدة قبل تسمية الخلايا بالأجسام المضادة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب الأنابيب لأعلى ولأسفل بشكل متكرر وعن طريق تضمين EDTA في المخزن المؤقت. يمكن استخدام السلف المنقى لأي تحليل خلوي وجزيئي في المصب.
على سبيل المثال ، نسخ الخلية الواحدة ، atesque ، مقايسات مستعمرة والكيمياء الحيوية. ساعدتنا هذه التقنية في اختبار التنبؤات من تجارب RNA-seq أحادية الخلية.
