Este protocolo permite a identificação e o isolamento de progenitores eritróides BFU-E e CFU-E diretamente de tecido de camundongo recém-colhido, como medula óssea e baço. Usando esta técnica, podemos isolar populações puras de progenitores eritróides, o que não foi possível com os protocolos de fluxo anteriores. Este método aumenta muito a nossa capacidade de estudar modelos de ratos com doenças eritróides, permitindo o isolamento de progenitores para muitos experimentos a jusante.
Para começar, coloque os fêmures e tíbias recém-dissecados diretamente no tampão de coloração a frio ou SB-5 e mantenha os tubos no gelo até que estejam prontos para extrair a medula óssea. Coloque uma argamassa esterilizada limpa no gelo em um balde e transfira os ossos para a argamassa. Usando a tesoura de dissecção, corte aproximadamente 1 milímetro de cada osso.
Use uma seringa de 3 mililitros equipada com uma agulha de calibre 26 contendo SB-5 para liberar a medula dos ossos e coletá-la na argamassa e repetir o processo de 3 a 5 vezes usando tampão fresco de cada vez até que os ossos pareçam incolores. Filtre a medula lavada através de uma malha de 100 micrômetros e colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mililitros colocado no gelo. Em seguida, use a argamassa e o pilão para esmagar os ossos lavados em 5 a 10 mililitros de SB-5.
Filtre a mistura de ossos esmagados e tampão através do filtro celular de 100 micrômetros para se agrupar com as células coletadas anteriormente. Configure um filtro de malha de 100 micrômetros em um tubo de centrífuga vazio de 50 mililitros colocado no gelo. Coloque um único baço no filtro de malha e adicione 0,5 a 1 mililitro de SB-5 ao baço para garantir que ele não seque.
Usando o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 3 ou 5 mililitros, amasse o baço através da malha. Adicione mais SB-5, 5 mililitros de cada vez, e continue a amassar até que todas as células tenham sido coletadas no tubo. Prepare uma suspensão de célula única pipetando para cima e para baixo as células coletadas com 2 mililitros de SB-5 usando uma grande ponta de orifício.
Coloração da fluorescência menos um ou controles FMO adicionando todos os anticorpos, exceto o anticorpo homônimo do FMO à suspensão celular no tubo FACS. Para manchar os controles de cor única, adicione um único anticorpo à suspensão celular no tubo FACS. Vórtice cada tubo de controle por 2 a 3 segundos a 3000 RPM e depois incube a 4 graus Celsius balançando por 2,5 horas no escuro.
Após a incubação, lave as células com SB-5 e compense o volume da suspensão celular em 4 mililitros com SB-5. Gire as células a 900 g por 10 minutos a 4 graus Celsius e aspirar o sobrenadante. Ressuspeite os controles não corados e todos os controles de cor única em 300 microlitros de SB-5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 micrômetros em novos tubos FACS.
Fazer uma solução de DAPI SB-5 diluindo o estoque de DAPI em uma proporção de 1 a 10.000 em SB-5. Ressuscite o FMOS em 1,8 mililitros de DAPI SB-5 e o controle de cor única DAPI em 300 microlitros de DAPI SB-5 e, em seguida, filtre-os através de uma malha de filtro de 40 micrômetros em novos tubos FACS. Depois de adicionar a mistura mestre de anticorpos a cada amostra, vórtice os tubos por 2 a 3 segundos a 3000 rpm, seguido de incubação a 4 graus Celsius no escuro por 2,5 horas na condição de balanço.
Depois de lavar as células, como demonstrado anteriormente, ressuspeite as amostras em 1,8 mililitros de DAPI SB-5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 micrômetros em um novo tubo FACS e analise as amostras usando um cistometer. Use a dispersão para a frente para remover os detritos com base no tamanho e, em seguida, use o histograma de altura de dispersão para frente versus histograma de área de dispersão para frente para excluir agregados de células e selecionar células únicas. Repita a exclusão com o histograma de altura de dispersão lateral versus área de dispersão lateral.
Exclua as células mortas eliminando as células positivas para DAPI. Selecione a linhagem negativa TUR uma 19 células positivas kit negativo. E destes seleciona-se uma subpopulação que expressa o CD 55.
Subdivida a linhagem negativa TUR um 19, kit negativo, positivo, CD 55 células positivas em 2 populações principais, P seis e P sete com base na expressão de CD 49 F e CD 1 0 5. Agora com base na expressão do CD 150 e CD 41, subdivida P 6 em P 3, P 4 e P 5. Da mesma forma, com base na expressão do CD 150 e do CD 71, subdivida P 7 ainda mais em BFUE, CFUE inicial e CFUE tardia.
No presente estudo, foram identificadas unidades de ruptura e formação de colônias a partir das células recém-colhidas da medula óssea e do baço. Após 72 horas de eritropoietina, ou injeção de veículo nos camundongos, a estimulação da eritropoietina mostrou expansão das populações de unidades de colônia precoce e tardia P 1 baixa e P 1 alta na medula óssea e células do baço colhidas. A resposta dos progenitores da medula óssea e do baço à eritropoietina in vivo também mostrou um maior número de células nas populações de unidades de formação de colônias precoces e tardias P 1 baixas e P 1 altas, em comparação com o controle do veículo.
É mais importante gerar uma única suspensão celular antes de rotular as células com anticorpos. Isso pode ser conseguido pipetando para cima e para baixo repetidamente e incluindo EDTA no buffer. Os progenitores purificados podem ser usados para qualquer análise celular e molecular a jusante.
Por exemplo, transcriptômica de célula única, atesco, ensaios de colônias e bioquímica. Essa técnica nos ajudou a testar as previsões de experimentos de RNA-seq de célula única.
