Этот протокол позволяет идентифицировать и выделять предшественников эритроидов BFU-E и CFU-E непосредственно из свежесобранной ткани мыши, такой как костный мозг и селезенка. Используя эту технику, мы можем выделить чистые популяции эритроидных прародителей, что было невозможно с предыдущими протоколами потока. Этот метод значительно повышает нашу способность изучать модели эритроидных заболеваний у мышей, позволяя выделять предшественников для многих последующих экспериментов.
Для начала поместите свежерассеченные бедренные кости и большеберцовую кость непосредственно в буфер холодного окрашивания или SB-5 и держите трубки на льду до готовности к извлечению костного мозга. Поместите чистый стерилизованный раствор на лед в ведро и переложите кости в раствор. Используя ножницы для рассечения, отрежьте примерно 1-миллиметровые концы каждой кости.
Используйте 3-миллилитровый шприц, оснащенный иглой 26 калибра, содержащей SB-5, чтобы вымыть костный мозг из костей и собрать его в ступку и повторять процесс от 3 до 5 раз, используя свежий буфер каждый раз, пока кости не пока не пока не пока кости не станут бесцветными. Отфильтруйте промытый костный мозг через 100-микрометровую сетку и соберите клетки в 50-миллилитровую центрифужную трубку, помещенную на лед. Затем используйте ступку и пестик, чтобы раздавить покрасневшие кости в 5-10 миллилитрах SB-5.
Фильтруйте смесь измельченных костей и буфер через 100-микрометровый клеточный сетчатый фильтр для объединения с ранее собранными клетками. Установите 100-микрометровый сетчатый фильтр на пустой 50-миллилитровой центрифужной трубке, помещенной на лед. Поместите одну селезенку на сетчатый фильтр и добавьте от 0,5 до 1 миллилитра SB-5 в селезенку, чтобы она не высохла.
Используя резиновую сторону плунжера для шприца объемом 3 или 5 миллилитров, размяните селезенку через сетку. Добавьте еще SB-5, по 5 миллилитров за один раз, и продолжайте размять, пока все клетки не будут собраны в трубку. Подготовьте одноэлементную суспензию, пипетируя вверх и вниз собранные ячейки с помощью 2 миллилитров SB-5 с помощью большого наконечника отверстия.
Окрашивают флуоресценцию минус один или контроль FMO путем добавления всех антител, кроме одноименного антитела FMO, к клеточной суспензии в трубке FACS. Чтобы окрасить одноцветные элементы управления, добавьте одно антитело к клеточной суспензии в трубке FACS. Вихрь каждой контрольной трубки в течение 2-3 секунд при 3000 об/мин, а затем инкубируют при 4 градусах Цельсия, раскачиваясь в течение 2,5 часов в темноте.
После инкубации промыть клетки СБ-5 и восполнить объем клеточной суспензии до 4 миллилитров с СБ-5. Раскрутите клетки при 900 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия и аспирируйте супернатант. Повторно приостановите незапятнанные и все одноцветные элементы управления в 300 микролитров SB-5 и фильтруйте через 40-микрометровую фильтрующую сетку в новые трубки FACS.
Изготавливают раствор DAPI SB-5 путем разбавления запаса DAPI в соотношении 1 к 10 000 в SB-5. Повторно подвешивайте FMOS в 1,8 миллилитрах DAPI SB-5 и одноцветное управление DAPI в 300 микролитрах DAPI SB-5, затем фильтруйте их через 40-микрометровую фильтрующую сетку в новые трубки FACS. После добавления смеси антител к каждому образцу вращайте трубки в течение 2-3 секунд при 3000 оборотах в минуту с последующей инкубацией при 4 градусах Цельсия в темноте в течение 2,5 часов в состоянии раскачивания.
После промывки клеток, как было показано ранее, повторно приостановите образцы в 1,8 миллилитрах DAPI SB-5 и фильтруйте через 40-микрометровую фильтрующую сетку в новую трубку FACS и анализируйте образцы с помощью цистометра. Используйте прямое рассеяние для удаления мусора в зависимости от размера, затем используйте гистограмму области прямого рассеяния по сравнению с гистограммой области прямого рассеяния, чтобы исключить агрегаты ячеек и выбрать отдельные ячейки. Повторите исключение с гистограммой высоты бокового рассеяния и области бокового рассеяния.
Исключите мертвые клетки, вытеснив положительные клетки для DAPI. Выберите линию отрицательного ТУР один 19 отрицательный набор положительных клеток. И из них выберите субпопуляцию, которая выражает CD 55.
Подразделяют линию отрицательной ТУР один 19, отрицательный набор, положительную, CD 55 положительную клетку на 2 основные популяции, P шесть и P семь на основе экспрессии CD 49 F и CD 1 0 5. Теперь, основываясь на выражении CD 150 и CD 41, подразделяют P 6 далее на P 3, P 4 и P 5. Аналогичным образом, основываясь на экспрессии CD 150 и CD 71, подразделяют P 7 далее на BFUE, ранний CFUE и поздний CFUE.
В настоящем исследовании разрывные и колониеобразующие единицы были идентифицированы из свежесобранных клеток костного мозга и селезенки. После 72 часов эритропоэтина или инъекции транспортного средства у мышей стимуляция эритропоэтина показала расширение ранних и поздних колониеобразующих единичных популяций P 1 низкий и P 1 высокий в собранных клетках костного мозга и селезенки. Реакция предшественников костного мозга и селезенки на эритропоэтин in vivo также показала более высокое количество клеток в ранних и поздних колониеобразующих единичных популяциях P 1 low и P 1 high по сравнению с контролем транспортных средств.
Наиболее важно генерировать одноклеточную суспензию, прежде чем маркировать клетки антителами. Это может быть достигнуто путем многократного пипетирования вверх и вниз и включения ЭДТА в буфер. Очищенные предшественники могут быть использованы для любого последующего клеточного и молекулярного анализа.
Например, одноклеточная транскриптомика, атеск, колониальные анализы и биохимия. Этот метод помог нам проверить прогнозы из экспериментов с одноклеточной РНК-seq.
