该协议允许直接从新鲜收获的小鼠组织（如骨髓和脾脏）中鉴定和分离BFU-E和CFU-E红系祖细胞。使用这种技术，我们可以分离出纯粹的红系祖细胞群，这在以前的流动方案中是不可能的。这种方法通过允许在许多下游实验中分离祖细胞，极大地增强了我们研究红系疾病小鼠模型的能力。
首先，将新鲜解剖的股骨和胫骨直接放入冷染色缓冲液或SB-5中，并将管子放在冰上，直到准备好提取骨髓。将干净的消毒砂浆放在桶中的冰上，然后将骨头转移到研钵中。使用解剖剪刀，剪掉每根骨头的大约 1 毫米末端。
使用配备含有SB-5的26号针头的3毫升注射器将骨髓从骨头中冲洗出来并将其收集到研钵中，每次使用新鲜缓冲液重复该过程3至5次，直到骨骼呈现无色。通过100微米网格过滤冲洗的骨髓，并将细胞收集在放置在冰上的50毫升离心管中。接下来，用研钵和研杵将冲洗过的骨头压碎在 5 到 10 毫升的 SB-5 中。
过滤碎骨的混合物，并通过100微米细胞过滤器缓冲液，与先前收集的细胞汇集。在放置在冰上的空50毫升离心管上设置100微米网状过滤器。将单个脾脏放在网状过滤器上，并在脾脏中加入 0.5 至 1 毫升 SB-5，以确保其不会干燥。
使用3或5毫升注射器柱塞的橡胶侧，将脾脏捣碎。添加更多的SB-5，一次5毫升，并继续捣碎，直到所有细胞都收集在管中。通过使用大孔尖端用 2 毫升 SB-5 上下移液收集的细胞来制备单细胞悬液。
通过将除 FMO 同名抗体以外的所有抗体添加到 FACS 管中的细胞悬液中，对荧光减去 1 或 FMO 对照进行染色。要对单色对照进行染色，请将单一抗体添加到FACS管中的细胞悬液中。以 3000 RPM 涡旋每个控制管 2 至 3 秒，然后在 4 摄氏度下在黑暗中摇摆 2.5 小时。
孵育后，用SB-5洗涤细胞，并用SB-5将细胞悬液的体积补足至4毫升。在4摄氏度下以900g旋转细胞10分钟并吸出上清液。将未染色的和所有单色对照重新悬浮在 300 微升 SB-5 中，并通过 40 微米过滤网过滤到新的 FACS 管中。
通过在SB-5中以1比10， 000的比例稀释DAPI SB-5来制备DAPI SB-5溶液。将FMOS重新悬浮在1.8毫升DAPI SB-5中，将DAPI单色对照重新悬浮在300微升DAPI SB-5中，然后通过40微米过滤网将它们过滤到新的FACS管中。将抗体预混液添加到每个样品中后，以 3000 rpm 的速度涡旋试管 2 至 3 秒，然后在黑暗中在 4 摄氏度下在摇摆条件下孵育 2.5 小时。
如前所述洗涤细胞后，将样品重新悬浮在 1.8 毫升 DAPI SB-5 中，并通过 40 微米过滤网过滤到新的 FACS 管中，并使用膀胱计分析样品。使用前向散射根据大小去除碎片，然后使用前向散射高度与前向散射区域直方图排除细胞聚集并选择单个细胞。使用侧向散射高度与侧向散射区域直方图重复排除。
通过门控DAPI的阳性细胞来排除死细胞。选择谱系阴性TUR一个19阴性试剂盒阳性细胞。并从中选择一个表达CD 55的亚群。
根据CD 49 F和CD 1 0 5的表达，将谱系阴性TUR 19，阴性试剂盒，阳性，CD 55阳性细胞细分为2个主要群体，P六和P七。现在基于CD 150和CD 41的表达，将P 6进一步细分为P 3，P 4和P 5。同样，基于CD 150和CD 71的表达，将P 7进一步细分为BFUE，早期CFUE和晚期CFUE。
在本研究中，从新鲜收获的骨髓和脾脏细胞中鉴定出爆裂和集落形成单位。在小鼠中注射促红细胞生成素或载体72小时后，促红细胞生成素刺激显示收获的骨髓和脾脏细胞中早期和晚期集落形成单位群体P1低和P 1高扩张。与载体对照相比，骨髓和脾脏祖细胞对体内促红细胞生成素的反应也显示出早期和晚期集落形成单位群体P 1低和P 1高细胞数量的细胞。
最重要的是在用抗体标记细胞之前产生单细胞悬液。这可以通过反复上下移液以及在缓冲液中加入EDTA来实现。纯化的祖细胞可用于任何下游细胞和分子分析。
例如，单细胞转录组学、atesque、集落测定和生物化学。这项技术帮助我们测试了单细胞RNA-seq实验的预测。
