يمكن استخدام هذا البروتوكول القائم على 96 صفيحة في المختبر لاختبار التأثير المثبط للأجسام المضادة على العوامل المضادة للفطريات الجديدة على النشاط الأيضي للخلايا الفطرية في الأغشية الحيوية المبيضات. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، هذه تقنية حساسة للغاية ودقيقة وعالية الإنتاجية وقابلة للتكرار وسهلة الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة لتقييم تأثير الأجسام المضادة أو مضادات الفطريات على تطوير الأغشية الحيوية المبيضات. يمكن استخدام هذا الفحص لتقييم فعالية العلاجات الجديدة القائمة على الأدوية أو الأجسام المضادة ، وكذلك اللقاحات المرشحة ضد الأغشية الحيوية المبيضات ، والتي ترتبط بشدة داء المبيضات الغازي.
يمكن تطبيق هذه الطريقة لاختبار تأثير العوامل المضادة للفطريات أو الأجسام المضادة الجديدة أثناء تكوين الأغشية الحيوية أو النضج في بيئات مختلفة باستخدام سلالات فطرية مختلفة أو مصادر أجسام مضادة. سيوضح هذا الإجراء السيد بانكاج تشاندلي ، وهو باحث دكتوراه يعمل في مختبري. للبدء ، أضف 100 ميكرولتر من ثقافة المبيضات الاستوائية إلى لوحة عيار 96 بئر.
باستخدام ماصة متعددة القنوات ، املأ العمودين الأخيرين ب 100 ميكرولتر من وسيط RPMI 1640 MOPS وحده. قم بتغطية لوحة المعايرة الدقيقة بغطاء ورقائق الألومنيوم واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسيط بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات.
اقلب اللوحة برفق على صفائح النشاف وانقر لإزالة أي وسيط متبقي. اغسل اللوحة ب 200 ميكرولتر من 1X PBS باستخدام ماصة متعددة القنوات. استنشاق PBS بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات ، واغسلها مرتين باستخدام PBS.
لإزالة PBS الزائد ، جفف اللوحة في الهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل خزانة السلامة البيولوجية. تحضير التخفيفات التسلسلية لعينات المصل المعطلة بالحرارة في وسط RPMI 1640 MOPS المعقم. أضف 100 ميكرولتر من مخفف المصل المحدد إلى كل بئر من لوحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 بئرا.
في العمود 10 ، أضف فقط RPMI 1640 MOPS المتوسطة للتحكم الإيجابي للفطريات فقط. أضف مخففا من واحد إلى 50 من المصل إلى جميع الآبار في العمود 11 ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي في المصل بدون فطريات. بعد تغطية اللوحة بغطاء ورقائق الألومنيوم ، احتضن اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، بعد شفط المصل بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات ، اضغط على اللوحة المقلوبة برفق لإزالة أي مصل متبقي. كرر غسل PBS ثلاث مرات ، وجفف اللوحة في الهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل خزانة السلامة البيولوجية لتجفيف أي PBS زائد. بعد ذلك ، قم بإذابة 25 ملليغرام من XTT في 50 ملليلتر من لاكتات رينغر المعقمة بالمرشح.
القسمة 10 ملليلتر في أنابيب منفصلة. قم بتغطيته بورق الألمنيوم وتخزينه في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بإذابة 8.6 ملليغرام من الميناديون في خمسة ملليلتر من الأسيتون.
وبعد توزيع 50 ميكرولتر في 100 أنبوب صغير منفصل ، قم بتخزين القسمة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. خذ 10 ملليلتر من XTT وأضف ميكرولتر واحد من ميناديون للحصول على حل عمل ميكرومولار واحد. أضف 100 ميكرولتر من محلول XTT menadione لكل بئر من لوحة المعايرة الدقيقة المكونة من 96 بئرا.
بعد ذلك ، بعد تغطية اللوحة بغطاء ورقائق الألومنيوم ، احتضن اللوحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في الظلام. أخيرا ، انقل 80 ميكرولترا من المادة الطافية الملونة من كل بئر إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا ، واقرأ اللوحة عند 490 نانومتر. يمكن أن يمنع المصل من الفئران المحصنة ضد Sap2-parapsilosis نضوج الأغشية الحيوية المبيضات الاستوائية المشكلة مسبقا بنسبة 65٪ مقارنة ب 45٪ في مصل الدم من Sap2-albicans ، و 55٪ في الفئران المحصنة ضد Sap2-tropicalis.
بشكل عام ، كان تثبيط الأغشية الحيوية بواسطة مصل Sap2 المناعي أعلى بكثير من مصل المناعة الوهمي ، وهو 16٪ و 13٪ في مصل ما قبل المناعة. كان تثبيط الأغشية الحيوية قريبا من الإهمال عند استخدام PBS وعدم التحكم في المصل. يجب توخي أقصى درجات الحذر أثناء تنفيذ خطوات الغسيل لمنع تعطيل الأغشية الحيوية.
يجب تحضير محلول XTT قبل الاستخدام مباشرة ، وإضافته إلى اللوحة على الفور. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للمستخدمين تقييم تأثير العوامل المضادة للفطريات الجديدة أو اللقاحات المرشحة أو الأجسام المضادة أثناء تكوين الأغشية الحيوية المبيضات ونضجها في بيئات بحثية مختلفة باستخدام سلالات فطرية مختلفة.
