Этот протокол in vitro на основе 96 пластин может быть использован для проверки ингибирующего действия антител на новые противогрибковые агенты на метаболическую активность грибковых клеток в биопленках Candida. По сравнению с другими методами, это высокочувствительный, точный, высокопроизводительный, воспроизводимый, удобный для пользователя и экономически эффективный метод оценки влияния антител или противогрибковых препаратов на развитие биопленок Candida. Этот анализ может быть использован для оценки эффективности новых лекарственных средств или антител, а также вакцин-кандидатов против биопленок Candida, которые связаны с тяжестью инвазивного кандидоза.
Этот метод может быть применен для тестирования эффекта новых противогрибковых агентов или антител во время образования или созревания биопленки в различных условиях с использованием различных грибковых штаммов или источников антител. Продемонстрировать эту процедуру будет г-н Панкадж Чандли, доктор философии, работающий в моей лаборатории. Для начала добавьте 100 микролитров культуры Candida tropicalis в 96-луночную микротитровую пластину.
Используя многоканальную пипетку, заполните последние две колонки 100 микролитрами только среды RPMI 1640 MOPS. Накройте микротитровую пластину крышкой и алюминиевой фольгой и инкубируйте пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в стационарных условиях. На следующий день тщательно аспирируйте среду с помощью многоканальной пипетки.
Аккуратно переверните пластину на листах для промокания и постучите, чтобы удалить остаточную среду. Вымойте пластину 200 микролитрами 1X PBS с помощью многоканальной пипетки. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки и дважды мойте PBS.
Чтобы удалить избыток PBS, высушите пластину на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности. Подготовка серийных разведений термоинактивированных образцов сыворотки в стерильной среде RPMI 1640 MOPS. Добавьте 100 микролитров выбранного разведения сыворотки в каждую лунку 96-луночной микротитровой пластины.
В колонке 10 добавьте только среду RPMI 1640 MOPS для положительного контроля только гриба. Добавьте от одного до 50 разведений сыворотки во все колодцы в колонке 11, чтобы служить в качестве отрицательного контроля без грибка плюс сыворотка. После покрытия пластины крышкой и алюминиевой фольгой, инкубируйте пластину в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия.
На следующий день, после тщательного аспирации сыворотки с помощью многоканальной пипетки, осторожно постучите по перевернутой пластине, чтобы удалить остаточную сыворотку. Повторите промывку PBS три раза и высушите пластину на воздухе в течение 30 минут при комнатной температуре внутри шкафа биологической безопасности, чтобы высушить любые излишки PBS. Затем растворите 25 миллиграммов XTT в 50 миллилитрах стерилизованного фильтром лактата Рингера.
Аликвот 10 миллилитров в отдельных тубах. Накройте его алюминиевой фольгой и храните при минус 80 градусах Цельсия. Далее растворяют 8,6 миллиграмма менадиона в пяти миллилитрах ацетона.
А после распределения 50 микролитров в 100 отдельных микротрубках храните аликвоты при минус 80 градусах Цельсия. Возьмите 10 миллилитров XTT и добавьте один микролитр менадиона, чтобы получить один микромолярный рабочий раствор. Добавьте 100 микролитров раствора менадиона XTT на лунку 96-луночной микротитровой пластины.
Далее, после покрытия пластины крышкой и алюминиевой фольгой, высиживают пластину в течение двух часов при 37 градусах Цельсия в темноте. Наконец, перенесите 80 микролитров цветного супернатанта из каждой скважины в свежую 96-луночную пластину и считайте пластину на 490 нанометров. Сыворотка от мышей, иммунизированных Sap2-парапсилезом, может предотвратить созревание предварительно сформированных биопленок Candida tropicalis на 65% по сравнению с 45% в сыворотке от Sap2-альбиканов и на 55% у мышей, иммунизированных Sap2-tropicalis.
В целом, ингибирование биопленки иммунной сывороткой Sap2 было значительно выше, чем в фиктивной иммунной сыворотке, что составляет 16% и 13% в преиммунной сыворотке. Ингибирование биопленки было близко к незначительному при использовании PBS и отсутствии сывороточного контроля. При выполнении этапов промывки следует проявлять максимальную осторожность, чтобы предотвратить разрушение биопленок.
Раствор XTT должен быть приготовлен непосредственно перед использованием и немедленно добавлен в тарелку. Следуя этой процедуре, пользователи могут оценить эффект новых противогрибковых агентов, вакцин-кандидатов или антител во время формирования и созревания биопленки Candida в различных исследовательских условиях с использованием различных грибковых штаммов.
