Este protocolo in vitro, baseado em placas de 96 poços, pode ser usado para testar o efeito inibitório de anticorpos em novos agentes antifúngicos na atividade metabólica de células fúngicas em biofilmes de Candida. Em comparação com outros métodos, esta é uma técnica altamente sensível, precisa, de alto rendimento, reprodutível, fácil de usar e econômica para avaliar o efeito de anticorpos ou antifúngicos no desenvolvimento de biofilmes de Candida. Este ensaio pode ser usado para avaliar a eficácia de novas terapias baseadas em medicamentos ou anticorpos, bem como candidatas a vacinas contra biofilmes de Candida, que estão associados à gravidade da candidíase invasiva.
Este método pode ser aplicado para testar o efeito de novos agentes antifúngicos ou anticorpos durante a formação ou maturação do biofilme em diferentes contextos usando diferentes cepas fúngicas ou fontes de anticorpos. Demonstrando esse procedimento estará o Sr. Pankaj Chandley, um pesquisador de doutorado que trabalha em meu laboratório. Para começar, adicione 100 microlitros de cultura de Candida tropicalis a uma placa de microtitulação de 96 poços.
Usando uma pipeta multicanal, preencha as duas últimas colunas com 100 microlitros de RPMI 1640 MOPS médios sozinhos. Cubra a placa de microtitulação com uma tampa e folha de alumínio e incube a placa por 24 horas a 37 graus Celsius em condições estacionárias. No dia seguinte, aspirar o meio cuidadosamente usando uma pipeta multicanal.
Inverta a placa suavemente sobre as folhas de blotting e toque para remover qualquer meio residual. Lave a placa com 200 microlitros de PBS 1X usando uma pipeta multicanal. Aspirar o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal e lavar duas vezes com PBS.
Para remover o excesso de PBS, seque a placa ao ar por 30 minutos à temperatura ambiente dentro de um gabinete de segurança biológica. Preparar diluições em série de amostras de soro inativadas pelo calor em meio estéril RPMI 1640 MOPS. Adicionar 100 microlitros da diluição sérica selecionada a cada poço da placa de microtitulação de 96 poços.
Na coluna 10, adicione apenas o meio RPMI 1640 MOPS para o controle positivo somente de fungos. Adicionar uma diluição de um a 50 do soro a todos os poços na coluna 11 para servir como o controle negativo do não-fungo mais soro. Depois de cobrir a placa com uma tampa e papel alumínio, incube a placa por 24 horas a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, depois de aspirar o soro cuidadosamente usando uma pipeta multicanal, toque suavemente na placa invertida para remover qualquer soro residual. Repita a lavagem do PBS três vezes e seque a placa ao ar livre por 30 minutos à temperatura ambiente dentro de um gabinete de segurança biológica para secar qualquer excesso de PBS. Em seguida, dissolva 25 miligramas de XTT em 50 mililitros de lactato de Ringer esterilizado por filtro.
Alíquota 10 mililitros em tubos separados. Cubra-o com papel alumínio e armazene-o a menos 80 graus Celsius. Em seguida, dissolva 8,6 miligramas de menadiona em cinco mililitros de acetona.
E depois de distribuir 50 microlitros em 100 microtubos separados, armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius. Tome 10 mililitros de XTT e adicione um microlitro de menadiona para obter uma solução de trabalho micromolar. Adicionar 100 microlitros da solução de menadiona XTT por poço da placa de microtitulação de 96 poços.
Em seguida, depois de cobrir a placa com uma tampa e papel alumínio, incube a placa por duas horas a 37 graus Celsius no escuro. Finalmente, transfira 80 microlitros do sobrenadante colorido de cada poço para uma nova placa de 96 poços e leia a placa a 490 nanômetros. O soro de camundongos imunizados com Sap2-parapsilose poderia prevenir a maturação de biofilmes pré-formados de Candida tropicalis em 65%, em comparação com 45% no soro de Sap2-albicans e 55% em camundongos imunizados com Sap2-tropicalis.
Em geral, a inibição do biofilme pelo soro imune Sap2 foi significativamente maior do que pelo soro imune simulado, que é de 16% e 13% no soro pré-imune. A inibição do biofilme foi quase insignificante no uso de PBS e sem controle sérico. Deve-se tomar o máximo cuidado ao realizar as etapas de lavagem para evitar a interrupção dos biofilmes.
A solução de XTT deve ser preparada imediatamente antes da utilização e adicionada à placa imediatamente. Após este procedimento, os usuários podem avaliar o efeito de novos agentes antifúngicos, candidatos a vacina ou anticorpos durante a formação e maturação do biofilme de Candida em diferentes ambientes de pesquisa usando diferentes cepas fúngicas.
