من خلال دراسة وظيفة الخلية الكأسية في الثقافة الأولية ، نكتسب رؤى قيمة حول الآليات الكامنة وراء الاختلافات القائمة على الجنس في صحة سطح العين. لقد قمنا بتعديل طريقة المزرعة الأولية لخلايا كأس الملتحمة المعمول بها بالفعل عن طريق القضاء على الهرمونات والمواد الاستروجينية من النظام ، مما يتيح تحكما أكثر دقة في مستويات هرمون الجنس. يعزز هذا التعديل دقة وموثوقية النتائج التي توصلنا إليها.
قياس الكالسيوم داخل الخلايا هو طريقة لدراسة وظيفة الخلية الكأسية تحت المحفزات المختلفة ومسارات الإشارات داخل الخلايا التي يسببها كل محفز. يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل تطوير الأدوية لأمراض سطح العين مثل حساسية العين أو مرض جفاف العين أو التهاب الملتحمة. تسهل هذه التقنية فحص تأثير الجزيئات المختلفة على الخلايا الكأسية تحت مستويات هرمون محددة.
غالبا ما يعاني الأشخاص الجدد في هذه التقنية من فصل أنسجة الملتحمة عن النسيج الضام. نصيحتنا هي إيلاء اهتمام وثيق للملمس والخصائص المادية للأنسجة. يجب أن تكون الملتحمة مرنة وشبه شفافة بينما يكون النسيج الضام عادة أفتح في اللون ويشبه ألياف القطن.
للبدء ، باستخدام مشرط معقم ، قم بفرم أنسجة الملتحمة البشرية إلى قطع مكعبة ملليمتر واحد. في صفيحة من ستة آبار ، قم بزرع أربع قطع في كل بئر تحتوي على ملليمتر واحد من وسط RPMI الكامل. تأكد من تثبيت القطع على اللوحة.
احتضان قطع الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ هواء. قم بتحديث وسيط الثقافة كل يومين. بعد 72 ساعة من البذر ، قم بإزالة سدادة الأنسجة واستمر في الحضانة حتى تصل الخلايا الكأسية إلى التقاء 70 إلى 80٪.
بعد ذلك ، شطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 0.05٪ التربسين EDTA لفصل الخلايا من أسفل اللوحة. مراقبة انفصال الخلية تحت المجهر. وبمجرد انفصال الخلايا ، أضف وسيط RPMI كاملا لإلغاء تنشيط التربسين.
قم بطرد مركزي لتعليق الخلية عند 150 G لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI الخالي من الفينول الأحمر. ثم أعد زرع تعليق الخلية على طبق استزراع قاع زجاجي لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. لتحميل Fura-2 AM ، أضف مخزن مؤقت بيكربونات Krebs-Ringer يحتوي على 0.5٪ HEPES و 0.5٪ BSA و 0.5 ميكرومولار Fura-2 AM وثمانية ميكرومولار حمض بلورونيك F127 و 250 ميكرومولار سلفينبيرازون في الطبق السفلي الزجاجي الذي يحتوي على خلايا كأس.
احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، وحمايتها من الضوء. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام مخزن بيكربونات كريبس رينجر الذي يحتوي على 250 ميكرومولار سلفينبيرازوني. لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، ضع الطبق الذي يحتوي على خلايا محملة ب Fura-2 تحت المجهر.
ثم أضف 200 مرة تكبير. حدد موقع حقل تمثيلي يحتوي على 20 إلى 50 خلية. باستخدام الوظيفة اليدوية ، ارسم مخططا تفصيليا حول كل خلية لتمييزها عن مضان الخلفية وانتظر حتى يقوم البرنامج تلقائيا بطرح مضان الخلفية من القياس.
انقر فوق الزر "بدء التجربة" وانتظر لمدة ثماني إلى 15 ثانية لتحديد مستويات الكالسيوم الأساسية في الخلايا. ثم أضف كارباكول ناهض الكوليني بعناية واستمر في القياس لمدة 120 ثانية على الأقل أو حتى تعود مستويات الكالسيوم إلى خط الأساس. باستخدام التغير في ذروة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، احسب متوسط مستوى الكالسيوم الأساسي في كل خلية من أول ثماني إلى 15 ثانية من القياسات.
قم بإزالة الخلايا التي تحتوي على متوسط مستوى الكالسيوم القاعدي يساوي أو يزيد عن 500 نانومولار من مجموعة البيانات. بعد ذلك ، احسب الحد الأقصى لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا لكل خلية. ثم اطرح قيمة مستوى الكالسيوم الأساسي من الحد الأقصى للتركيز داخل الخلايا المقاس لنفس الخلية.
أخيرا ، متوسط التغير في ذروة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا لجميع الخلايا في الطبق. تم تأكيد نقاء الخلايا الكأسية الملتحمة البشرية عن طريق تلطيخ المناعي ، باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بعلامات الخلايا الكأسية ، السيتوكيراتين و Helix pomatia lectin 1. أظهرت نتائج فحص Fura-2 AM عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين الخلايا المحتضنة في RPMI الخالي من الفينول الأحمر مع 1٪ BSA ووسط RPMI كامل.
ومع ذلك ، لوحظت زيادة كبيرة في استجابة الكالسيوم داخل الخلايا للكارباكول عند مقارنة المجموعة المتوسطة RPMI المتقدمة بمجموعة RPMI المتوسطة الكاملة. الشيء الأكثر أهمية هو الحصول على ثقافة الخلايا الكأسية البشرية الأولية ذات الكثافة الخلوية الكافية. أثناء النمو ، تأكد من أن قطع الأنسجة تلتصق بلوحة الاستزراع لتحقيق نمو فعال.
يمكن للباحثين استكشاف مشاركة مسارات محددة من خلال تطبيق مثبطات مختلفة ، أو استهداف المستقبلات أو جزيئات الإشارة إلى الخلايا قبل التحفيز. يمكن أيضا تقييم المعلمات الأخرى التي تشير إلى وظيفة الخلية الكأسية ، مثل إفراز الميوسين وتعطيل كينازات البروتين المنشط للميتوجين. توفر القياسات التكميلية فهما شاملا لاستجابة الخلايا الكأسية للمحفزات المختلفة.
