Ao estudar a função das células caliciformes em cultura primária, obtemos informações valiosas sobre os mecanismos por trás das diferenças baseadas no sexo na saúde da superfície ocular. Modificamos o já estabelecido método de cultura primária de células caliciformes caliciformes, eliminando hormônios e substâncias estrogênicas do sistema, permitindo um controle mais preciso dos níveis de hormônios sexuais. Essa modificação aumenta a acurácia e a confiabilidade de nossos achados.
A medida intracelular de cálcio é um método para estudar a função das células caliciformes sob diversos estímulos e as vias de sinalização intracelular desencadeadas por cada estímulo. A técnica pode ser estendida ao desenvolvimento de medicamentos para doenças da superfície ocular, como alergia ocular, doença do olho seco ou conjuntivite. Esta técnica facilita a triagem do efeito de várias moléculas nas células caliciformes sob níveis hormonais específicos.
Pessoas novas nesta técnica muitas vezes lutam com a separação do tecido conjuntival do tecido conjuntivo. Nosso conselho é prestar muita atenção à textura e às propriedades do material do tecido. A conjuntiva deve ser elástica e semitransparente, enquanto o tecido conjuntivo é geralmente de cor mais clara e semelhante à fibra de algodão.
Para começar, usando um bisturi estéril, pique o tecido conjuntival humano em pedaços cúbicos de um milímetro. Em uma placa de seis poços, semeie quatro pedaços em cada poço contendo um milímetro de meio RPMI completo. Certifique-se de ancorar as peças ao prato.
Incube os pedaços de tecido a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de ar. Atualize o meio de cultura a cada dois dias. Após 72 horas da semeadura, remova o tampão de tecido e continue a incubação até que as células caliciformes atinjam 70 a 80% de confluência.
Em seguida, lave as células com PBS e adicione 0,05% de tripsina EDTA para separar as células do fundo da placa. Observe o descolamento celular ao microscópio. E uma vez que as células se desprendam, adicione um meio RPMI completo para desativar a tripsina.
Centrifugar a suspensão celular a 150 G por cinco minutos e ressuspender o pellet em meio RPMI livre de vermelho fenol. Em seguida, resemeie a suspensão celular em uma placa de cultura com fundo de vidro para medição da concentração de cálcio intracelular. Para o carregamento de Fura-2 AM, adicione o tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo 0,5%HEPES, 0,5%BSA e 0,5 Fura-2 AM micromolares, oito ácido plurônico micromolar F127 e 250 sulfinpirazona micromolar na placa de fundo de vidro contendo células caliciformes.
Incubar as células durante uma hora a 37 graus Celsius, protegendo-as da luz. Após a incubação, lavar as células com tampão de bicarbonato Krebs-Ringer contendo 250 micromolares sulfinpirazona. Para a medição da concentração intracelular de cálcio, coloque a placa contendo células carregadas com Fura-2 sob o microscópio.
Em seguida, adicione 200 vezes a ampliação. Localize um campo representativo contendo 20 a 50 células. Usando a função à mão livre, desenhe um contorno ao redor de cada célula para distingui-la da fluorescência de fundo e aguarde que o software subtraia automaticamente a fluorescência de fundo da medição.
Clique no botão Iniciar experimento e aguarde de oito a 15 segundos para determinar os níveis basais de cálcio nas células. Em seguida, adicione cuidadosamente o agonista colinérgico carbacol e continue a medir por pelo menos 120 segundos ou até que os níveis de cálcio tenham retornado aos valores basais. Usando a mudança na concentração de pico de cálcio intracelular, calcular o nível médio de cálcio basal em cada célula dos primeiros oito a 15 segundos de medição.
Remover do conjunto de dados células com nível médio de cálcio basal igual ou superior a 500 nanomolares. Em seguida, calcule a concentração máxima de cálcio intracelular para cada célula. Em seguida, subtraia o valor do nível basal de cálcio da concentração intracelular máxima medida para a mesma célula.
Finalmente, faça uma média da mudança no pico de concentração de cálcio intracelular para todas as células de um prato. A pureza das células caliciformes da conjuntiva humana foi confirmada pela coloração por imunofluorescência, utilizando-se anticorpos específicos para os marcadores de células caliciformes, citoqueratina e lectina Helix pomatia 1. Os resultados do ensaio Fura-2 AM não mostraram diferenças significativas entre as células incubadas em RPMI livre de fenol vermelho com BSA 1% e meio RPMI completo.
No entanto, um aumento significativo da resposta intracelular de cálcio ao carbacol foi observado quando comparado o grupo do meio RPMI avançado com o grupo do meio RPMI completo. O mais importante é obter cultura primária de células caliciformes humanas de densidade celular suficiente. Durante o crescimento, certifique-se de que os pedaços de tecido grudem na placa de cultura para um crescimento eficaz.
Os pesquisadores poderiam explorar o envolvimento de vias específicas aplicando vários inibidores, visando receptores ou moléculas sinalizadoras para as células antes da estimulação. Os outros parâmetros indicativos da função das células caliciformes, como secreção de mucina e desativação de proteínas quinases ativadas por mitógenos, também podem ser avaliados. As medidas complementares fornecem uma compreensão abrangente da resposta das células caliciformes a diferentes estímulos.
