Изучая функцию бокаловидных клеток в первичной культуре, мы получаем ценную информацию о механизмах, лежащих в основе половых различий в здоровье глазной поверхности. Мы модифицировали уже зарекомендовавший себя метод первичного культивирования бокаловидных клеток конъюнктивы, исключив из системы гормоны и эстрогенные вещества, что позволило более точно контролировать уровень половых гормонов. Эта модификация повышает точность и надежность наших выводов.
Внутриклеточное измерение кальция - это метод изучения функции бокаловидных клеток при различных стимулах и внутриклеточных сигнальных путей, запускаемых каждым стимулом. Этот метод может быть распространен на разработку лекарств для лечения заболеваний глазной поверхности, таких как глазная аллергия, синдром сухого глаза или конъюнктивит. Этот метод облегчает скрининг влияния различных молекул на бокаловидные клетки при определенных уровнях гормонов.
Люди, не знакомые с этой техникой, часто испытывают трудности с отделением конъюнктивальной ткани от соединительной. Мы советуем обратить пристальное внимание на текстуру и свойства материала ткани. Конъюнктива должна быть эластичной и полупрозрачной, в то время как соединительная ткань обычно светлее по цвету и похожа на хлопковое волокно.
Для начала с помощью стерильного скальпеля измельчите ткань конъюнктивы человека на кусочки размером в один миллиметр. В шестилуночном планшете засейте по четыре кусочка в каждую лунку, содержащую один миллиметр полной среды RPMI. Обязательно закрепите кусочки на тарелке.
Инкубируйте кусочки ткани при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 95% воздуха. Обновляйте питательную среду через день. Через 72 часа после посева удалите тканевую пробку и продолжайте инкубацию до тех пор, пока бокаловидные клетки не достигнут 70-80% слияния.
Затем промойте клетки PBS и добавьте 0,05% трипсина ЭДТА, чтобы отделить клетки от нижней части пластины. Наблюдайте за отслоением клеток под микроскопом. И как только клетки отделятся, добавьте полную среду RPMI, чтобы деактивировать трипсин.
Центрифугируют клеточную суспензию при 150 G в течение пяти минут и ресуспендируют гранулы в среде RPMI, не содержащей фенолового красного. Затем пересейте клеточную суспензию в культуральную чашку со стеклянным дном для измерения внутриклеточной концентрации кальция. Для загрузки Фура-2 АМ добавьте бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий 0,5% HEPES, 0,5% BSA и 0,5 микромоляра Fura-2 AM, восемь микромолярных плуроновых кислот F127 и 250 микромоляров сульфинпиразона в чашку со стеклянным дном, содержащую бокалобойные клетки.
Инкубируйте клетки в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, защищая их от света. После инкубации промывают клетки бикарбонатным буфером Кребса-Рингера, содержащим 250 микромолярных сульфинпиразонов. Для измерения внутриклеточной концентрации кальция поместите чашку с клетками, загруженными Fura-2, под микроскоп.
Затем добавьте 200-кратное увеличение. Найдите репрезентативное поле, содержащее от 20 до 50 ячеек. Используя функцию свободной руки, нарисуйте контур вокруг каждой ячейки, чтобы отличить ее от фоновой флуоресценции, и подождите, пока программное обеспечение автоматически вычтет фоновую флуоресценцию из измерения.
Нажмите кнопку «Начать эксперимент» и подождите от восьми до 15 секунд, чтобы определить исходный уровень кальция в клетках. Затем осторожно добавьте холинергический агонист карбахол и продолжайте измерение не менее 120 секунд или до тех пор, пока уровень кальция не вернется к исходному уровню. Используя изменение пиковой внутриклеточной концентрации кальция, рассчитайте средний базальный уровень кальция в каждой клетке за первые 8-15 секунд измерений.
Удалите из набора данных клетки со средним базальным уровнем кальция, равным или превышающим 500 наномоляров. Далее рассчитайте максимальную внутриклеточную концентрацию кальция для каждой клетки. Затем вычтите значение базального уровня кальция из максимальной измеренной внутриклеточной концентрации для той же клетки.
Наконец, усредните изменение пиковой внутриклеточной концентрации кальция для всех клеток в чашке. Чистота бокаловидных клеток конъюнктивы человека была подтверждена с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием антител, специфичных к маркерам бокаловидных клеток, цитокератину и лектину Helix pomatia 1. Результаты анализа Fura-2 AM не показали существенных различий между клетками, инкубированными в РПМИ без фенола красного с 1% БСА и полной средой РПМИ.
Тем не менее, значительное увеличение внутриклеточного кальциевого ответа на карбахол наблюдалось при сравнении средней группы с прогрессирующей средней группой RPMI и полной средней группой RPMI. Самое главное – получить первичную культуру бокаловидных клеток человека достаточной клеточной плотности. Во время роста следите за тем, чтобы кусочки ткани прилипали к культуральной пластине для эффективного отрастания.
Исследователи могут изучить участие определенных путей путем применения различных ингибиторов, нацеленных на рецепторы или сигнальные молекулы к клеткам перед стимуляцией. Другие параметры, указывающие на функцию бокаловидных клеток, такие как секреция муцина и дезактивация митоген-активируемых протеинкиназ, также могут быть оценены. Дополнительные измерения дают всестороннее представление о реакции бокалочных клеток на различные раздражители.
