Al estudiar la función de las células caliciformes en cultivo primario, obtenemos información valiosa sobre los mecanismos detrás de las diferencias basadas en el sexo en la salud de la superficie ocular. Hemos modificado el método de cultivo primario de células caliciformes conjuntivales ya establecido mediante la eliminación de hormonas y sustancias estrogénicas del sistema, lo que permite un control más preciso de los niveles de hormonas sexuales. Esta modificación mejora la precisión y confiabilidad de nuestros hallazgos.
La medición del calcio intracelular es un método para estudiar la función de las células caliciformes bajo diversos estímulos y las vías de señalización intracelular desencadenadas por cada estímulo. La técnica puede extenderse al desarrollo de fármacos para enfermedades de la superficie ocular como la alergia ocular, la enfermedad del ojo seco o la conjuntivitis. Esta técnica facilita la detección del efecto de varias moléculas en las células caliciformes bajo niveles hormonales específicos.
Las personas nuevas en esta técnica a menudo tienen dificultades para separar el tejido conjuntival del tejido conectivo. Nuestro consejo es prestar mucha atención a la textura y a las propiedades del material del tejido. La conjuntiva debe ser elástica y semitransparente, mientras que el tejido conectivo suele ser de color más claro y similar a la fibra de algodón.
Para empezar, con un bisturí estéril, pica el tejido conjuntival humano en trozos cúbicos de un milímetro. En una placa de seis pocillos, siembre cuatro piezas en cada pocillo que contengan un milímetro de medio RPMI completo. Asegúrate de anclar las piezas al plato.
Incubar las piezas de tejido a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de aire. Actualice el medio de cultivo cada dos días. Después de 72 horas desde la siembra, retire el tapón de tejido y continúe la incubación hasta que las células caliciformes alcancen un 70 a 80% de confluencia.
A continuación, enjuague las células con PBS y agregue 0,05% de tripsina EDTA para separar las células del fondo de la placa. Observe el desprendimiento de células bajo un microscopio. Y una vez que las células se desprenden, agregue un medio RPMI completo para desactivar la tripsina.
Centrifugar la suspensión celular a 150 G durante cinco minutos y resuspender el pellet en medio RPMI libre de rojo fenol. A continuación, vuelva a sembrar la suspensión celular en una placa de cultivo con fondo de vidrio para medir la concentración de calcio intracelular. Para la carga de Fura-2 AM, agregue tampón de bicarbonato Krebs-Ringer que contenga 0,5 % de HEPES, 0,5 % de BSA y 0,5 micromolares de Fura-2 AM, ocho micromolares de ácido plurónico F127 y 250 micromolares de sulfinpirazona en el plato con fondo de vidrio que contiene células caliciformes.
Incubar las células durante una hora a 37 grados centígrados, protegiéndolas de la luz. Después de la incubación, lavar las células con tampón de bicarbonato Krebs-Ringer que contiene 250 micromolares de sulfinpirazona. Para la medición de la concentración de calcio intracelular, coloque la placa que contiene las células cargadas con Fura-2 bajo el microscopio.
A continuación, añade un aumento de 200 veces. Localice un campo representativo que contenga de 20 a 50 celdas. Usando la función a mano alzada, dibuje un contorno alrededor de cada celda para distinguirla de la fluorescencia de fondo y espere a que el software reste automáticamente la fluorescencia de fondo de la medición.
Haga clic en el botón Iniciar experimento y espere de ocho a 15 segundos para determinar los niveles de calcio de referencia en las células. A continuación, agregue con cuidado el agonista colinérgico carbachol y continúe midiendo durante al menos 120 segundos o hasta que los niveles de calcio hayan vuelto a la línea de base. Utilizando el cambio en la concentración máxima de calcio intracelular, calcule el nivel medio de calcio basal en cada célula de los primeros ocho a 15 segundos de las mediciones.
Elimine del conjunto de datos las células que tengan un nivel medio de calcio basal igual o superior a 500 nanomolares. A continuación, calcule la concentración máxima de calcio intracelular para cada célula. A continuación, reste el valor del nivel basal de calcio de la concentración intracelular máxima medida para la misma célula.
Finalmente, promedie el cambio en la concentración máxima de calcio intracelular para todas las células en un plato. La pureza de las células caliciformes conjuntivales humanas se confirmó mediante tinción inmunofluorescente, utilizando anticuerpos específicos para los marcadores de células caliciformes, citoqueratina y lectina Helix pomatia 1. Los resultados del ensayo Fura-2 AM no mostraron diferencias significativas entre las células incubadas en RPMI libre de rojo de fenol con 1% de BSA y medio RPMI completo.
Sin embargo, se observó un aumento significativo de la respuesta del calcio intracelular al carbacol cuando se comparó el grupo de medio RPMI avanzado con el grupo completo de medio RPMI. Lo más importante es obtener un cultivo primario de células caliciformes humanas con una densidad celular suficiente. Durante el crecimiento, asegúrese de que las piezas de tejido se adhieran a la placa de cultivo para un crecimiento efectivo.
Los investigadores pudieron explorar la participación de vías específicas mediante la aplicación de varios inhibidores, la dirección de receptores o moléculas de señalización a las células antes de la estimulación. También se pueden evaluar otros parámetros indicativos de la función de las células caliciformes, como la secreción de mucina y la desactivación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos. Las mediciones complementarias proporcionan una comprensión completa de la respuesta de las células caliciformes a diferentes estímulos.
