استخلاص اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي وتحديد درجة حرارة تخزينه

تهدف هذه الطريقة إلى إظهار تقنية مباشرة لاستخراج البروتين ، مفيدة للحصول على البروتينات الوفيرة وعوامل أخرى. يمكن استخدام هذه التقنية لاستخراج العوامل والبروتينات الأخرى الموجودة في الغشاء الأمنيوسي وأيضا للحصول على البروتينات من مصادر أخرى مثل الحيوانات والأنسجة النباتية. ابدأ بإذابة 100 ملليغرام من الغشاء الأمنيوسي الذي تم الحصول عليه من بنك السلى.

بمجرد إذابة الجليد ، أضف 10 ملليلتر من محلول الملح المتوازن المعقم إلى طبق بتري واغسل الغشاء لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الملح المتوازن المستخدم في دورق وكرر العملية حتى لا يظهر أي أثر لوسط الجلسرين في طبق بتري. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من dispase II إلى الغشاء واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، قم بإجراء إزالة الظهارة الميكانيكية باستخدام مكشطة خلية شرطي مطاطية. بعد ذلك ، تصور الغشاء تحت مجهر مقلوب لتأكيد إزالة الاندمال الظهاري. بعد ذلك ، اغسل الغشاء الأمنيوسي غير الظهاري بمحلول الملح المتوازن المعقم كما هو موضح سابقا ، وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر.

ثم اغمر الأنبوب الذي يحتوي على الغشاء في النيتروجين السائل لمدة 40 دقيقة. بعد التجميد باستخدام النيتروجين السائل ، قم بطحن الغشاء يدويا لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في ملاط ، مبرد مسبقا عند 85 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم. بعد ذلك ، أضف 2.5 ملليلتر من محلول مثبطات الأنزيم البروتيني وقم بإذابة الغشاء المسحوق ناعما.

قم بتنظيف جدران الهاون بمساعدة سكين مشرط ونقل الخليط إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بتجانس خليط الأنسجة عن طريق الطرد المركزي أولا عند 34 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بالطرد المركزي على الفور مرة أخرى عند 3،360 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

في نهاية الطرد المركزي ، اجمع الطافي ، وهو مستخلص الغشاء الأمنيوسي ، في أنبوب جديد. بعد ذلك ، حاصل على 0.7 ملليلتر في أنبوب طرد مركزي دقيق مختلف سعة 2 ملليلتر لنقاط زمنية ودرجات حرارة مختلفة. تأثرت كمية البروتين الكلية وتركيز اللوميكان في مستخلص الغشاء الأمنيوسي بالوقت وظروف التخزين.

كان تركيز البروتين القاعدي مشابها بين جميع مستخلصات الغشاء الأمنيوسي. ومع ذلك ، لوحظ تركيز بروتين مرتفع بشكل ملحوظ في المستخلص المخزن لمدة 32 يوما عند أربع درجات مئوية و 20 يوما عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. كان اللوميكان في مستخلص الغشاء الأمنيوسي أعلى بشكل ملحوظ في العينة المخزنة لمدة 12 يوما مقارنة بالعينات المخزنة لمدة 30 و 20 وستة أيام عند أربعة و 20 درجة مئوية تحت الصفر.

اقترحت هذه النتائج أن وقت التخزين ودرجة الحرارة المناسبين لتحقيق أعلى تركيز للوميكان هو 12 يوما عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. مارس أقصى درجات الحذر أثناء تأريض الغشاء الأمنيوسي المجمد. يجب أن يكون التأريض لطيفا لأنه قد يسقط من الهاون.

هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد دور مستخلص الغشاء الأمنيوسي lumican في الخلايا الظهارية القرنية وتحديد الجرعة المثالية من lumican لإعادة الاندمال الظهاري للقرنية.