羊膜からのルミカン抽出とその保管温度の決定

この方法は、豊富なタンパク質やその他の要因の獲得に役立つタンパク質抽出のための簡単な技術を実証することを目的としています。この技術は、羊膜に存在する他の因子およびタンパク質を抽出するために、また、動物および植物組織などの他の供給源からタンパク質を得るために使用することができる。羊膜バンクから得られた100ミリグラムの羊膜を解凍することから始めます。

解凍したら、10ミリリットルの滅菌平衡塩溶液をペトリ皿に加え、膜を2分間洗浄します。次に、使用済みのバランスの取れた塩溶液をビーカーに移し、ペトリ皿に微量のグリセロール培地が見えなくなるまでこのプロセスを繰り返します。次に、10ミリリットルのディスパーゼIIを膜に加え、摂氏37度と5%二酸化炭素で30分間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、ゴム製の警官細胞スクレーパーで機械的脱上皮化を行います。次に、倒立顕微鏡で膜を可視化し、脱上皮化を確認します。次に、前に示したように、脱上皮化した羊膜を滅菌平衡塩溶液で洗浄し、2ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。

次いで、膜を入れたチューブを液体窒素に40分間浸漬する。液体窒素で凍結した後、微粉末が得られるまで、マイナス85°Cで予め冷却した乳鉢で2〜3分間膜を手動で粉砕する。次に、2.5ミリリットルのプロテアーゼ阻害剤溶液を加え、微粉末膜を可溶化する。

メスナイフの助けを借りてモルタルの壁をきれいにし、混合物を5ミリリットルのチューブに移します。チューブを30秒間ボルテックスします。次に、最初に摂氏4度で20分間34Gで遠心分離し、直ちに摂氏4度で20分間3,360Gで再度遠心分離することにより、組織混合物を均質化する。

遠心分離の最後に、羊膜抽出物である上清を新しいチューブに集めます。次に、さまざまな時点と温度で、異なる2ミリリットルの微量遠心チューブに0.7ミリリットルを分注します。羊膜抽出物中の総タンパク質量およびルミカン濃度は、時間と保存条件の影響を受けました。

基礎タンパク質濃度は羊膜抽出物中で同程度であった。しかし、摂氏4度で32日間、マイナス20°Cで20日間保存された抽出物には、有意に高いタンパク質濃度が認められました。羊膜抽出物中のルミカンは、摂氏4度で30日、20日、6日間保存した場合と比較して、12日間保存されたサンプルで有意に高かった。

これらの結果から,ルミカンの最高濃度を達成するための適切な保存時間と温度は,マイナス20°Cで12日間であることが示唆された。凍結羊膜を接地するときは細心の注意を払ってください。モルタルから落ちる可能性があるため、接地は穏やかでなければなりません。

角膜上皮細胞における羊膜抽出物ルミカンの役割を決定し、角膜再上皮化のためのルミカンの理想的な用量を決定するには、さらなる研究が必要です。.