Diese Methode zielt darauf ab, eine einfache Technik für die Proteinextraktion zu demonstrieren, die für die Gewinnung von reichlich vorhandenen Proteinen und anderen Faktoren nützlich ist. Diese Technik könnte verwendet werden, um andere Faktoren und Proteine in der Amnionmembran zu extrahieren und auch Proteine aus anderen Quellen wie Tieren und pflanzlichem Gewebe zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Auftauen von 100 Milligramm der Amnionmembran, die aus der Amnionbank gewonnen wird.
Nach dem Auftauen 10 Milliliter der sterilen ausgewogenen Salzlösung in eine Petrischale geben und die Membran zwei Minuten lang waschen. Dann die verwendete ausgewogene Salzlösung in ein Becherglas geben und den Vorgang wiederholen, bis keine Spur von Glycerinmedium in der Petrischale sichtbar ist. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter Dispase II zur Membran hinzu und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 30 Minuten.
Am Ende der Inkubation führen Sie eine mechanische Deepithelialisierung mit einem Gummipolizisten-Zellschaber durch. Visualisieren Sie dann die Membran unter einem inversen Mikroskop, um die Deepithelisierung zu bestätigen. Als nächstes waschen Sie die deepithelialisierte Amnionmembran mit der sterilen ausgewogenen Salzlösung, wie zuvor gezeigt, und legen Sie sie in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Tauchen Sie dann das Röhrchen mit der Membran für 40 Minuten in flüssigen Stickstoff. Nach dem Einfrieren mit flüssigem Stickstoff die Membran manuell für zwei bis drei Minuten in einem Mörser mahlen, der bei minus 85 Grad Celsius vorgekühlt wird, bis ein feines Pulver entsteht. Als nächstes fügen Sie 2,5 Milliliter Proteaseinhibitorlösung hinzu und lösen die fein pulverisierte Membran auf.
Reinigen Sie die Mörtelwände mit Hilfe eines Skalpellmessers und geben Sie die Mischung in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen. Wirbeln Sie die Röhre für 30 Sekunden. Dann homogenisieren Sie die Gewebemischung, indem Sie zuerst bei 34 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und sofort wieder bei 3, 360 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Am Ende der Zentrifugation den Überstand, den Amnionmembranextrakt, in einem neuen Röhrchen sammeln. Dann aliquot 0,7 Milliliter in einem anderen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für verschiedene Zeitpunkte und Temperaturen. Die Gesamtproteinmenge und Lumicankonzentration im Amnionmembranextrakt wurden durch Zeit und Lagerbedingungen beeinflusst.
Die Basalproteinkonzentration war bei allen Amnionmembranextrakten ähnlich. Allerdings wurde eine signifikant hohe Proteinkonzentration in dem Extrakt festgestellt, der 32 Tage bei vier Grad Celsius und 20 Tage bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurde. Lumican im Amnionmembranextrakt war in der für einen Zeitraum von 12 Tagen gelagerten Probe signifikant höher als in den Proben, die für 30, 20 und sechs Tage bei vier und minus 20 Grad Celsius gelagert wurden.
Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die geeignete Lagerzeit und Temperatur zum Erreichen der höchsten Konzentration von Lumican 12 Tage bei minus 20 Grad Celsius beträgt. Seien Sie äußerst vorsichtig, während Sie die gefrorene Fruchtmembran erden. Die Erdung sollte sanft sein, da sie aus dem Mörtel herausfallen könnte.
Weitere Studien sind erforderlich, um die Rolle von Amnionmembranextrakt Lumican in Hornhautepithelzellen zu bestimmen und die ideale Dosis von Lumican für die Hornhautreepithelialisierung zu bestimmen.
