يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثير xenobiotics على البرسيم أثناء تحليل الأيض غير المستهدف. هذه التقنية بسيطة للغاية ومريحة للتشغيل ويمكن تحديد المزيد من أنواع إفرازات الجذر. مما يساعد على بناء البصمة الأيضية لإفرازات جذور النبات.
ابدأ تعقيم بذور ميديكاغو ساتيفا أو البرسيم عن طريق شطف البذور ب 0.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10 دقائق. يليه غسل مع 75 ٪ الكحول الإيثيلي لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، شطف البذور المعقمة عدة مرات بالماء المقطر.
ثم تنبتها على ورق الترشيح الرطب الموضوع في طبق بتري معقم. عند 30 درجة مئوية في الظلام. بعد الإنبات ، انقل 20 بذرة ممتلئة كبيرة نبتة بشكل موحد إلى سلة نقش في زجاجة استزراع مملوءة بمحلول مغذي.
ضع جميع زجاجات الثقافة في غرفة نمو ذات ظروف مسيطر عليها. بعد أسبوعين ، انقل 15 شتلة برسيم موحدة إلى زجاجة زجاجية جديدة لتعريضها لملليغرام واحد لكل كيلوغرام و 10 ملليغرام لكل كيلوغرام إجهاد DEHP لتجربة الاستزراع. لف عبوات المعالجة والتحكم بورق الألمنيوم والبارافيلم لمنع التحلل الضوئي وتطاير DEHP.
تكملة محلول المغذيات يوميا للحفاظ على مستوى السائل. ضع الزجاجات وقم بتدويرها بشكل عشوائي كل يومين لضمان ظروف نمو متسقة لشتلات البرسيم. بعد سبعة أيام من الزراعة ، قم بإزالة شتلات البرسيم من الزجاجات.
واغسلها بماء عالي النقاء عدة مرات لتحضيرها لجمع إفرازات الجذر. ابدأ تجربة جمع إفرازات الجذر عن طريق نقل 10 شتلات برسيم موحدة إلى أنابيب طرد مركزي مملوءة ب 50 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات المعقم. لجمع إفرازات الجذر ، احتفظ بالأنابيب في وضع مستقيم لمدة ست ساعات مع غمر الجذور في الماء.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، لف أنابيب الطرد المركزي بورق الألمنيوم لحماية الجذور من الضوء. قم بإزالة النباتات وتجميد السائل الذي تم جمعه لتنميط الأيض. تابع تجربة الاستخراج بإضافة 1.8 ملليلتر من محلول الاستخراج إلى العينات المجففة بالتجميد.
في دوامة لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، ضع الموجات فوق الصوتية على الأنابيب لمدة 10 دقائق في حمام ماء مثلج. قبل الطرد المركزي للعينات.
انقل بعناية 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. نضح 45 ميكرولتر من المادة الطافية من أنبوب الطرد المركزي ومزجها في مراقبة الجودة أو عينات مراقبة الجودة بحجم نهائي يبلغ 270 ميكرولتر. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتجميد المستخلصات في مكثف فراغ.
بمجرد اكتمال التجفيف ، أضف خمسة ميكرولترات من الريبونوكلياز القياسي الداخلي واستمر في التجفيف. بعد التبخر ، أضف 30 ميكرولترا من محلول هيدروكلوريد ميثوكسياأمينيون واحتضان الأنابيب عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من كاشف BSTFA إلى العينات قبل وضع الأنابيب عند 70 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للاشتقاق.
بمجرد انتهاء الحضانة ووصول العينة المشتقة إلى درجة حرارة الغرفة، أضف خمسة ميكرولترات من استرات ميثيل الأحماض الدهنية الذائبة في الكلوروفورم إلى العينات المشتقة. باستخدام عمود شعري بقياس 30 مترا × 250 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر ، افصل ميكرولتر واحد من إفرازات الجذر مع هيليوم غاز ناقل بمعدل تدفق 1.0 ملليلتر في الدقيقة. اضبط درجة حرارة الحقن على 280 درجة مئوية.
والحفاظ على درجة حرارة خط النقل عند 280 درجة مئوية. اضبط برنامج الفرن للفصل. بعد فصل المستخلصات ، قم بإجراء قياس الطيف الكتلي في وضع تصادم الإلكترون بطاقة ناقص 70 إلكترون فولت.
الحفاظ على درجة حرارة مصدر الأيونات عند 250 درجة مئوية. احصل على أطياف الكتلة باستخدام وضع مراقبة المسح الكامل مع نطاق مسح كتلي من 50 إلى 500 كتلة عن طريق الشحن بمعدل 12.5 أطياف في الثانية. تم الكشف عن 778 قمة في كروماتوجراف عينة التحكم.
تم تحديد 314 مستقلبا منها وفقا لأطياف الكتلة. تم تقسيم الأحماض إلى أحماض دهنية وأحماض أمينية وأحماض عضوية وأحماض فينولية. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف أيضا عن بعض المواد الشائعة الموجودة بشكل عام في إفرازات جذر البرسيم بما في ذلك البيريميدين والهيدروكسي بيريميدين والفلافونويد والفينولات والكيتونات والبيريميدين والديتيربينات.
تم رسم خريطة حرارية بناء على درجة VIP لتصور التباين في المستقلبات التفاضلية بين علاجات DEHP المختلفة. بالمقارنة مع عينات التحكم ، أدى التعرض ل DEHP إلى تغيير كبير في محتوى 50 مستقلبا وإفرازات جذر البرسيم. بما في ذلك أساسا بعض الكربوهيدرات والأحماض العضوية منخفضة الوزن الجزيئي.
أظهر تحليل المسارات الأيضية أن DEHP يثبط بشكل كبير عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات التي هي نتاج التمثيل الضوئي مما يشير إلى أن DEHP يمكن أن يثبط التمثيل الضوئي للبرسيم إلى حد ما ، وقد شوهد DEHP لتعزيز عملية التمثيل الغذائي للأحماض الدهنية التي تساعد على مقاومة الإجهاد من DEHP. يجب إجراء إفرازات جذر البذور على الأقل لكل علاج لضمان تحليل دقيق للبيانات الأيضية. يمكننا تحديد التمثيل الغذائي التفاضلي ومواصلة التحقيق في القواعد المهمة في السلوك البيئي للملوثات.
يمكن فك رموز التفاعلات بين النباتات والمجتمع البيولوجي الميداني الأوسع في الغالب باستخدام هذه الطريقة.
