Dieses Protokoll beschreibt, wie die Auswirkungen von Xenobiotika auf Luzerne während einer nicht zielgerichteten Metabolomik-Analyse bewertet werden können. Die Technik ist sehr einfach und bequem zu bedienen und es können mehr Arten von Wurzelexsudaten identifiziert werden. Dies hilft, den metabolomischen Fingerabdruck von Pflanzenwurzelexsudaten zu konstruieren.
Beginnen Sie die Sterilisation der Medicago sativa- oder Luzernesamen, indem Sie die Samen 10 Minuten lang mit 0,1 % Natriumhypochlorit abspülen. Anschließend 30 Minuten lang mit 75%igem Ethylalkohol waschen. Spülen Sie die sterilisierten Samen anschließend mehrmals mit destilliertem Wasser ab.
Und keimen Sie dann auf dem feuchten Filterpapier, das in eine sterile Petrischale gelegt wird. Bei 30 Grad Celsius im Dunkeln. Nach der Keimung 20 gleichmäßig gekeimte, große, pralle Samen in einen Pfropfkorb in einer mit Nährlösung gefüllten Kulturflasche geben.
Stellen Sie alle Kulturflaschen in eine Wachstumskammer mit kontrollierten Bedingungen. Übertragen Sie nach zwei Wochen 15 einheitliche Luzerne-Sämlinge in eine neue Glasflasche, um sie für das Kulturexperiment einem Milligramm pro Kilogramm und 10 Milligramm pro Kilogramm DEHP-Stress auszusetzen. Wickeln Sie die Behandlungs- und Kontrollglasflaschen mit Aluminiumfolie und Parafilm ein, um eine Photolyse und Verflüchtigung des DEHP zu verhindern.
Ergänzen Sie die Nährlösung täglich, um den Flüssigkeitsstand aufrechtzuerhalten. Platzieren und drehen Sie die Flaschen alle zwei Tage nach dem Zufallsprinzip, um konsistente Wachstumsbedingungen für die Luzerne-Sämlinge zu gewährleisten. Entfernen Sie nach sieben Tagen Anbau die Luzerne-Sämlinge aus den Flaschen.
Und waschen Sie sie mehrmals mit Reinstwasser, um sie auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen vorzubereiten. Beginnen Sie das Experiment zur Sammlung von Wurzelexsudat, indem Sie 10 gleichmäßige Luzernesämlinge in Zentrifugenröhrchen geben, die mit 50 Millilitern sterilisiertem deionisiertem Wasser gefüllt sind. Um Wurzelausscheidungen zu sammeln, halten Sie die Schläuche sechs Stunden lang aufrecht und tauchen Sie die Wurzeln in Wasser.
Wenn Sie fertig sind, wickeln Sie die Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ein, um die Wurzeln vor Licht zu schützen. Entfernen Sie die Pflanzen und gefrieren Sie die gesammelte Flüssigkeit für die Erstellung von Metabolitenprofilen. Fahren Sie mit dem Extraktionsexperiment fort, indem Sie den gefriergetrockneten Proben 1,8 Milliliter Extraktionslösung hinzufügen.
30 Sekunden im Wirbel. Wenden Sie anschließend die Ultraschallwellen 10 Minuten lang in einem Eiswasserbad auf die Röhren an. Vor dem Zentrifugieren der Proben.
200 Mikroliter Überstand vorsichtig in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Saugen Sie 45 Mikroliter Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen ab und mischen Sie es mit einem Endvolumen von 270 Mikrolitern in Qualitätskontroll- oder QC-Proben. Sobald Sie fertig sind, gefrieren Sie die Extrakte in einem Vakuumkonzentrator.
Sobald die Trocknung abgeschlossen ist, fügen Sie fünf Mikroliter interne Standard-Ribonuklease hinzu und trocknen Sie weiter. Nach dem Verdampfen werden 30 Mikroliter Methoxyaminierungshydrochloridlösung hinzugefügt und die Röhrchen 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes fügen Sie den Proben 40 Mikroliter BSTFA-Reagenz hinzu, bevor Sie die Röhrchen für 1,5 Stunden zur Derivatisierung bei 70 Grad Celsius platzieren.
Sobald die Inkubation beendet ist und die derivatisierte Probe Raumtemperatur erreicht hat, fügen Sie den derivatisierten Proben fünf Mikroliter in Chloroform gelöste Fettsäuremethylester hinzu. Mit einer Kapillarsäule von 30 mal 250 Mikrometern mal 0,25 Mikrometer trennen Sie einen Mikroliter der Wurzelexsudate mit einem Trägergas Helium bei einem Durchfluss von 1,0 Milliliter pro Minute. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 280 Grad Celsius ein.
Und halten Sie die Temperatur der Transferleitung bei 280 Grad Celsius. Stellen Sie das Ofenprogramm auf Trennung ein. Nach dem Trennen der Extrakte wird eine Massenspektrometrie im Elektronenkollisionsmodus mit einer Energie von minus 70 Elektronenvolt durchgeführt.
Halten Sie die Temperatur der Ionenquelle bei 250 Grad Celsius. Erfassen Sie Massenspektren mit dem Full-Scan-Überwachungsmodus mit einem Massenscanbereich von 50 bis 500 Masse durch Ladung bei einer Rate von 12,5 Spektren pro Sekunde. 778 Peaks wurden im Chromatographen der Kontrollprobe nachgewiesen.
Davon wurden 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert. Die Säuren wurden weiter unterteilt in Fettsäuren, Aminosäuren, organische Säuren und Phenolsäuren. Darüber hinaus wurden auch einige gängige Substanzen, die im Allgemeinen in den Wurzelexsudaten vorhanden sind, in Luzernewurzelexsudaten nachgewiesen, darunter Pyrimidine, Hydroxypyrimidine, Flavonoide, Phenole, Ketone, Pyrimidine und Diterpene.
Basierend auf dem VIP-Score wurde eine Heatmap erstellt, um die Variation der differentiellen Metaboliten zwischen verschiedenen DEHP-Behandlungen zu visualisieren. Im Vergleich zu den Kontrollproben veränderte die DEHP-Exposition den Gehalt an 50 Metaboliten und Luzernewurzelexsudaten signifikant. Enthält hauptsächlich einige Kohlenhydrate und niedermolekulare organische Säuren.
Die Analyse der Stoffwechselwege zeigte, dass DEHP den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, die das Produkt der Photosynthese sind, signifikant hemmt, was darauf hindeutet, dass DEHP die Photosynthese von Luzerne bis zu einem gewissen Grad unterdrücken kann. DEHP fördert den Stoffwechsel von Fettsäuren, die helfen, Stress durch DEHP zu widerstehen. Zumindest die Samenwurzelexsudate sollten für jede Behandlung durchgeführt werden, um eine genaue Analyse der metabolomischen Daten zu gewährleisten. Wir können differentielle Metabolisierungen bestimmen und die wichtigen Regeln im Umweltverhalten von Schadstoffen weiter untersuchen.
Die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und der weiteren biologischen Gemeinschaft können vor allem mit dieser Methode entschlüsselt werden.
