Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa mientras se realiza un análisis metabolómico no dirigido. La técnica es muy simple y conveniente para la operación y se pueden identificar más tipos de exudados de raíz. Lo que ayuda a construir la huella metabolómica de los exudados de la raíz de la planta.
Comience la esterilización de las semillas de medicago sativa o alfalfa enjuagando las semillas con hipoclorito de sodio al 0,1% durante 10 minutos. Seguido de un lavado con alcohol etílico al 75% durante 30 minutos. A continuación, enjuague las semillas esterilizadas varias veces con agua destilada.
Y luego germinarlos en el papel de filtro húmedo colocado en una placa de Petri estéril. A 30 grados centígrados en la oscuridad. Después de la germinación, transfiera 20 semillas grandes y regordetas germinadas uniformemente a una canasta de injerto en una botella de cultivo llena de solución nutritiva.
Colocar todas las botellas de cultivo en una cámara de crecimiento con condiciones controladas. Después de dos semanas, transfiera 15 plántulas de alfalfa uniformes a una nueva botella de vidrio para exponerlas a un miligramo por kilogramo y 10 miligramos por kilogramo de estrés DEHP para el experimento de cultivo. Envuelva las botellas de vidrio de tratamiento y control con papel de aluminio y parafilm para evitar la fotólisis y volatilización del DEHP.
Complemente la solución nutritiva diariamente para mantener el nivel de líquido. Coloque y gire aleatoriamente las botellas cada dos días para garantizar condiciones de crecimiento consistentes para las plántulas de alfalfa. Después de siete días de cultivo, retire las plántulas de alfalfa de las botellas.
Y lávelos con agua ultrapura varias veces para prepararlos para la recolección de exudados de raíces. Comience el experimento de recolección de exudado de raíz transfiriendo 10 plántulas de alfalfa uniformes a tubos de centrifugación llenos de 50 mililitros de agua desionizada esterilizada. Para recoger los exudados de la raíz, mantenga los tubos en posición vertical durante seis horas con las raíces sumergidas en agua.
Una vez hecho esto, envuelva los tubos de centrífuga con papel de aluminio para proteger las raíces de la luz. Retire las plantas y liofilique el líquido recogido para el perfil de metabolitos. Proceda con el experimento de extracción agregando 1.8 mililitros de solución de extracción a las muestras liofilizadas.
En vórtice durante 30 segundos. A continuación, aplique las ondas de ultrasonido a los tubos durante 10 minutos en un baño de agua helada. Antes de centrifugar las muestras.
Transfiera cuidadosamente 200 microlitros de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Aspire 45 microlitros de sobrenadante del tubo de centrífuga y mézclelo en muestras de control de calidad o control de calidad a un volumen final de 270 microlitros. Una vez hecho esto, liofilizar los extractos en un concentrador de vacío.
Una vez que se complete el secado, agregue cinco microlitros de ribonucleasa estándar interna y continúe secando. Después de la evaporación, agregue 30 microlitros de solución de clorhidrato de metoxiaminación e incube los tubos a 80 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, agregue 40 microlitros de reactivo BSTFA a las muestras antes de colocar los tubos a 70 grados centígrados durante 1,5 horas para la derivatización.
Una vez finalizada la incubación y la muestra derivatizada alcance la temperatura ambiente, añadir cinco microlitros de ésteres metílicos de ácidos grasos disueltos en cloroformo a las muestras derivatizadas. Usando una columna capilar que mide 30 metros por 250 micrómetros por 0.25 micrómetros, separe un microlitro de los exudados de la raíz con un gas portador helio a una velocidad de flujo de 1.0 mililitros por minuto. Ajuste la temperatura de inyección a 280 grados centígrados.
Y mantenga la temperatura de la línea de transferencia a 280 grados centígrados. Ajuste el programa del horno para la separación. Después de separar los extractos, realice espectrometría de masas en modo de colisión de electrones con una energía de menos 70 electronvoltios.
Mantenga la temperatura de la fuente de iones a 250 grados centígrados. Obtenga espectros de masas utilizando el modo de monitoreo de escaneo completo con un rango de escaneo de masa de 50 a 500 masa por carga a una velocidad de 12.5 espectros por segundo. Se detectaron 778 picos en el cromatógrafo de la muestra de control.
De los cuales se identificaron 314 metabolitos según los espectros de masas. Los ácidos se subdividieron en ácidos grasos, aminoácidos, ácidos orgánicos y ácidos fenólicos. Además, algunas sustancias comunes generalmente presentes en los exudados de la raíz también se detectaron en los exudados de la raíz de alfalfa, incluyendo pirimidinas, hidroxipirimidinas, flavonoides, fenoles, cetonas, pirimidinas y diterpenos.
Se trazó un mapa de calor basado en la puntuación VIP para visualizar la variación en los metabolitos diferenciales entre los diferentes tratamientos con DEHP. En comparación con las muestras de control, la exposición al DEHP cambió significativamente el contenido de 50 metabolitos y exudados de raíz de alfalfa. Principalmente incluyendo algunos carbohidratos y ácidos orgánicos de bajo peso molecular.
El análisis de las vías metabólicas mostró que el DEHP inhibió significativamente el metabolismo de los carbohidratos que son el producto de la fotosíntesis, lo que indica que el DEHP puede suprimir la fotosíntesis de la alfalfa hasta cierto punto, se observó que el DEHP promueve el metabolismo de los ácidos grasos que ayudan a resistir el estrés del DEHP. Al menos los exudados de la raíz de la semilla deben realizarse para cada tratamiento para garantizar un análisis preciso de los datos metabolómicos. Podemos determinar el metabolismo diferencial e investigar más a fondo las reglas importantes en el comportamiento ambiental de los contaminantes.
Las interacciones entre las plantas y la comunidad biológica de campo más amplia se pueden descifrar principalmente mediante el uso de este método.
