Questo protocollo descrive come valutare l'impatto degli xenobiotici sull'erba medica durante l'analisi metabolomica non mirata. La tecnica è molto semplice e conveniente per il funzionamento e possono essere identificati più tipi di essudati radicali. Che aiuta a costruire l'impronta digitale metabolomica degli essudati delle radici delle piante.
Iniziare la sterilizzazione dei semi di medicago sativa o erba medica sciacquando i semi con ipoclorito di sodio allo 0,1% per 10 minuti. Seguito da un lavaggio con alcool etilico al 75% per 30 minuti. Quindi, sciacquare i semi sterilizzati più volte con acqua distillata.
E poi germinarli sulla carta da filtro umida posta in una capsula di Petri sterile. A 30 gradi Celsius al buio. Dopo la germinazione, trasferire 20 grandi semi paffuti germinati uniformemente su un cesto di attecchimento in una bottiglia di coltura piena di soluzione nutritiva.
Posizionare tutte le bottiglie di coltura in una camera di crescita con condizioni controllate. Dopo due settimane, trasferire 15 piantine di erba medica uniformi in una nuova bottiglia di vetro per esporle a un milligrammo per chilogrammo e 10 milligrammi per chilogrammo di stress DEHP per l'esperimento di coltura. Avvolgere le bottiglie di vetro di trattamento e controllo con fogli di alluminio e parafilm per prevenire la fotolisi e la volatilizzazione del DEHP.
Integrare la soluzione nutritiva ogni giorno per mantenere il livello del liquido. Posizionare e ruotare casualmente le bottiglie ogni due giorni per garantire condizioni di crescita coerenti per le piantine di erba medica. Dopo sette giorni di coltivazione, rimuovere le piantine di erba medica dalle bottiglie.
E lavarli con acqua ultrapura più volte per prepararli alla raccolta degli essudati radicali. Inizia l'esperimento di raccolta dell'essudato radicale trasferendo 10 piantine di erba medica uniformi in provette da centrifuga riempite con 50 millilitri di acqua deionizzata sterilizzata. Per raccogliere gli essudati delle radici, tenere i tubi in posizione verticale per sei ore con le radici immerse nell'acqua.
Una volta fatto, avvolgere i tubi della centrifuga con un foglio di alluminio per proteggere le radici dalla luce. Rimuovere le piante e liofilizzare il liquido raccolto per la profilazione dei metaboliti. Procedere con l'esperimento di estrazione aggiungendo 1,8 millilitri di soluzione di estrazione ai campioni liofilizzati.
In vortice per 30 secondi. Quindi, applicare le onde ultrasoniche ai tubi per 10 minuti in un bagno di acqua ghiacciata. Prima di centrifugare i campioni.
Trasferire con cautela 200 microlitri di surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aspirare 45 microlitri di surnatante dalla provetta della centrifuga e mescolarlo in campioni di controllo qualità o QC per un volume finale di 270 microlitri. Una volta fatto, liofilizzare gli estratti in un concentratore sottovuoto.
Una volta completata l'essiccazione, aggiungere cinque microlitri di ribonucleasi standard interna e continuare l'asciugatura. Dopo l'evaporazione, aggiungere 30 microlitri di soluzione di metossiaminazione cloridrato e incubare i tubi a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, aggiungere 40 microlitri di reagente BSTFA ai campioni prima di posizionare le provette a 70 gradi Celsius per 1,5 ore per la derivatizzazione.
Una volta terminata l'incubazione e il campione derivatizzato raggiunge la temperatura ambiente, aggiungere cinque microlitri di esteri metilici di acidi grassi disciolti in cloroformio ai campioni derivatizzati. Utilizzando una colonna capillare di 30 metri per 250 micrometri per 0,25 micrometri, separare un microlitro di essudati radicali con un elio gas vettore ad una portata di 1,0 millilitri al minuto. Impostare la temperatura di iniezione su 280 gradi Celsius.
E mantenere la temperatura della linea di trasferimento a 280 gradi Celsius. Impostare il programma del forno per la separazione. Dopo aver separato gli estratti, eseguire la spettrometria di massa in modalità collisione elettronica con un'energia di meno 70 elettronvolt.
Mantenere la temperatura della sorgente di ioni a 250 gradi Celsius. Ottieni spettri di massa utilizzando la modalità di monitoraggio a scansione completa con un intervallo di scansione di massa da 50 a 500 masse di carica a una velocità di 12,5 spettri al secondo. Sono stati rilevati 778 picchi nel cromatografo del campione di controllo.
Di cui 314 metaboliti sono stati identificati secondo gli spettri di massa. Gli acidi sono stati ulteriormente suddivisi in acidi grassi, amminoacidi, acidi organici e acidi fenolici. Inoltre, alcune sostanze comuni generalmente presenti negli essudati radicali sono state rilevate anche negli essudati delle radici di erba medica, tra cui pirimidine, idrossi pirimidine, flavonoidi, fenoli, chetoni, pirimidine e diterpeni.
È stata tracciata una mappa di calore basata sul punteggio VIP per visualizzare la variazione dei metaboliti differenziali tra i diversi trattamenti DEHP. Rispetto ai campioni di controllo, l'esposizione al DEHP ha modificato significativamente il contenuto di 50 metaboliti ed essudati di radici di erba medica. Principalmente includendo alcuni carboidrati e acidi organici a basso peso molecolare.
L'analisi delle vie metaboliche ha mostrato che il DEHP ha inibito significativamente il metabolismo dei carboidrati che sono il prodotto della fotosintesi, indicando che il DEHP può sopprimere la fotosintesi dell'erba medica in una certa misura Il DEHP è stato visto per promuovere il metabolismo degli acidi grassi che aiutano a resistere allo stress da DEHP. Almeno gli essudati delle radici del seme devono essere eseguiti per ogni trattamento per garantire un'accurata analisi dei dati metabolomici. Possiamo determinare il metabolismo differenziale e indagare ulteriormente le regole importanti nel comportamento ambientale dei contaminanti.
Le interazioni tra le piante e la comunità biologica del campo più ampio possono essere decifrate principalmente utilizzando questo metodo.
