عند الحديث عن الأهمية ، يعد توليد الخلايا القاتلة الطبيعية من مصدر قابل للتوسيع أمرا بالغ الأهمية لتطبيقات مثل العلاج المناعي للسرطان. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنه يمكن استخدام الخلايا الجذعية المحتملة الموسعة التي تمتلك قدرة تمايز أوسع بدلا من خلايا IP العادية. للتمايز المسبق ل hEPSCs ، قم بإزالة وسيط hEPSC الذي تم فيه الحفاظ على الخلايا وإضافة ملليلتر واحد من وسط DFK.
احتضان لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. للتحقق من تكوين الأجسام الجنينية ، بعد إزالة وسط DFK المستهلك ، اغسل الخلايا مرة واحدة مع ملليلتر واحد من PBS. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث إلى سبع دقائق ، بناء على المورفولوجيا.
بمجرد إزالة التربسين ، واثنين ملليلتر من DFK المتوسطة لحصاد الخلايا. قم بتدوير الخلايا عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف ملليلتر واحد من وسط DFK وميكرولتر واحد من Y-27632 وأعد تعليق الخلايا عن طريق النقر.
عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وتخفيف تعليق الخلية مع DFK المتوسطة و Y-27632 للحصول على 4،000 خلية لكل 25 ميكرولتر من المتوسط. ضع 30 إلى 40 قطرة من معلق الخلية على غطاء طبق بتري 10 سم واسكب بعض PBS في الطبق السفلي لمنع تبخر القطرات. اقلب الغطاء برفق لتغطية الطبق واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.
لجمع الأجسام الجنينية من القطرة ، باستخدام ماصة ملليلتر واحد تحتوي على PBS ، قم بضخ القليل من PBS في القطرة وشفط الوسط ، بما في ذلك الأجسام الجنينية. بعد ذلك، انقل هذه الأجسام الجنينية إلى أنبوب حجمه 15 ملليلترا وقم بتدويرها لأسفل عند 100 G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف ملليلترا واحدا من المتوسط A.انقل الأجسام الجنينية المجمعة إلى صفيحة غير ملتصقة مكونة من 24 بئرا واعتبرها في اليوم صفر.
لأداء نمط الأديم المتوسط للأجسام الجنينية ، احتضان اللوحة لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثاني ، استبدل 500 ميكرولتر من الوسط المستهلك A بوسط A جديد من نفس الحجم. لإجراء مواصفات الدم البطانية للجسم الجنيني ، قم بإزالة 700 ميكرولتر من الوسط A من البئر وأضف نفس الحجم من الوسط B.Culture لمدة سبعة أيام ، مع تغيير نصف الوسائط كل يومين.
لنقل الأجسام الجنينية المنقوشة إلى واجهة هوائية / سائلة ، قم بإمالة اللوحة قليلا بحيث تتجمع الأجسام الجنينية في الأسفل ، وباستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط B. الآن التقط أجسام الجنين باستخدام ماصة عن طريق استنشاق الوسط المتبقي ونقلها إلى بئر عابر في لوحة من 24 بئرا ، لإجراء توسيع السلف اللمفاوي ، أضف 500 ميكرولتر من وسط NK-1 إلى الجزء السفلي من البئر العابر ، والثقافة لمدة 14 يوما ، وقم بإجراء تغيير متوسط كل يوم. لطلاء اللوحة ، قم بتخفيف مادة الطلاء في PBS ، وأضف ملليلتر واحد من محلول الطلاء المخفف إلى كل بئر من لوحة 12 بئرا ، وقم بتغطية فتحة اللوحة بغشاء تغليف.
احتضان لوحة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى البئر العابر وببطء ماصة لأعلى ولأسفل حوالي خمس إلى ست مرات لحصاد الخلايا المنبعثة من المواد العضوية. انقل معلق الخلية المحصودة إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط NK-1. قم بإزالة كل محلول الطلاء من البئر واغسل كل بئر من لوحة 12 بئرا مع ملليلتر واحد من PBS مرتين. بعد ذلك ، قم بتقسيم الخلايا المحصودة بنسبة 1: 2 ونقل تعليق الخلية إلى لوحة مطلية من 12 بئرا.
أضف ملليلترا واحدا من وسط NK-1 بحيث يحتوي كل بئر على 1.5 ملليلتر من المتوسط. لتغيير الوسط ، اترك الخلايا تغرق في القاع لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك ، قم بشفط 750 ميكرولترا من الوسط بعناية وقم بتدويرها لأسفل كما هو موضح سابقا.
بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها في 750 ميكرولتر من وسط NK-1 عن طريق سحب خمس إلى ست مرات ونقلها إلى البئر الأصلي. في هذه الدراسة ، تم تحليل المنتجات المشتقة من hEPSC في نقطة النهاية. ما يقرب من 15٪ من الخلايا المنفصلة عن نظام الاستزراع ثلاثي الأبعاد من دفعتين مستحثتين في نقاط زمنية مختلفة كانت CD3 سلبية ، CD56 إيجابية ، و 16٪ من الخلايا كانت CD45 إيجابية ، CD-56 إيجابية ، وهو ما يتماشى مع النسب المئوية للخلايا CD3 السلبية ، CD56 الإيجابية التي شوهدت في التجارب السابقة.
تراوحت النسب المئوية للخلايا السلبية CD3 والخلايا الإيجابية CD56 في الخلايا التي تم حصادها من نظام الثقافة ثنائية الأبعاد من 30 إلى 6٪أظهرت المنتجات المشتقة من hEPSC خلال اليوم 18 من نظام 2D تعبيرا عن كل من CD56 خارج الرحم و CD107a في 12٪ من الخلايا بعد ساعتين من تحفيز الأجسام المضادة ، وحوالي 28٪ من الخلايا المحصودة كانت إيجابية CD94 ، CD159a إيجابية. تم اختبار منتجات التمايز في المختبر للسمية الخلوية ضد خلايا الدم الحمراء البشرية K562. عند الاستزراع المشترك مع أهداف الورم لمدة ثلاث ساعات ، تظهر المنتجات المتمايزة سمية خلوية خفيفة مقارنة بخلايا خط الخلايا الدائمة المستقلة عن إنترلوكين 2 NK92mi.
باتباع هذه الطريقة ، يمكن إنشاء خلايا مثل الخلايا التائية والخلايا البائية وكريات الدم الحمراء.
