Apropos Signifikanz: Die Erzeugung von NK-Zellen aus einer expandierbaren Quelle ist für Anwendungen wie die Krebsimmuntherapie von entscheidender Bedeutung. Der Vorteil dieser Technologie besteht darin, dass anstelle von regulären IP-Zellen erweiterte potenzielle Stammzellen mit breiterer Differenzierungsfähigkeit verwendet werden können. Für die Vordifferenzierung von hEPSC-Werten wird das hEPSC-Medium, in dem die Zellen gehalten wurden, entfernt und ein Milliliter DFK-Medium hinzugefügt.
Zwei bis drei Tage bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Um die Bildung von embryoiden Körpern zu überprüfen, waschen Sie die Zellen nach dem Entfernen des verbrauchten DFK-Mediums einmal mit einem Milliliter PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,05% Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei bis sieben Minuten, basierend auf der Morphologie.
Sobald das Trypsin entfernt ist, und zwei Milliliter DFK-Medium, um die Zellen zu ernten. Schleudern Sie die Zellen bei 300 g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen des Überstands fügen Sie einen Milliliter DFK-Medium und einen Mikroliter Y-27632 hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Schnippen.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellsuspension mit DFK-Medium und Y-27632, um 4.000 Zellen pro 25 Mikroliter Medium zu erhalten. Geben Sie 30 bis 40 Tropfen Zellsuspension auf die Kappe einer 10 Zentimeter langen Petrischale und gießen Sie etwas PBS in die untere Schale, um die Verdunstung der Tröpfchen zu verhindern. Drehen Sie die Kappe vorsichtig um, um die Schale abzudecken, und inkubieren Sie sie drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Um die embryonalen Körper aus dem Tröpfchen zu sammeln, pumpen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette, die PBS enthält, ein wenig PBS in das Tröpfchen und saugen Sie das Medium, einschließlich der embryoiden Körper, ab. Dann überführen Sie diese embryonalen Körper in ein 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie bei 100 g für eine Minute bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen des Überstands fügen Sie einen Milliliter des Mediums A hinzu.Die gesammelten embryonalen Körper werden auf eine nicht haftende 24-Well-Platte übertragen und als Tag Null betrachtet.
Um eine Mesoderm-Strukturierung der embryonalen Körper durchzuführen, inkubieren Sie die Platte drei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie am zweiten Tag 500 Mikroliter verbrauchtes Medium A durch frisches Medium A des gleichen Volumens. Um die hämatoendotheliale Spezifikation des embryoiden Körpers durchzuführen, entfernen Sie 700 Mikroliter Medium A aus der Vertiefung und fügen Sie sieben Tage lang das gleiche Volumen des Mediums B hinzu.
Um die gemusterten embryonalen Körper auf eine Luft/Flüssigkeit-Grenzfläche zu übertragen, kippen Sie die Platte leicht, so dass die Embryoidkörper am Boden aggregieren, und entfernen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette so viel Medium B wie möglich. Nehmen Sie nun die Embryokörper mit einer Pipette auf, indem Sie das verbleibende Medium absaugen und sie in eine Trans-Well-Platte in eine 24-Well-Platte überführen. Um eine lymphatische Vorläuferexpansion durchzuführen, fügen Sie 500 Mikroliter NK-1-Medium in das untere Kompartiment des Trans-Wells hinzu, kultivieren Sie 14 Tage lang und führen Sie jeden zweiten Tag einen Mediumswechsel durch. Um die Platte zu beschichten, verdünnen Sie das Beschichtungsmaterial in PBS, fügen Sie einen Milliliter verdünnte Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu und decken Sie die Öffnung der Platte mit einer Umhüllungsfolie ab.
Inkubieren Sie die Platte bei vier Grad Celsius über Nacht. Geben Sie 200 Mikroliter PBS in den Trans-Well und pipettieren Sie langsam etwa fünf bis sechs Mal auf und ab, um die von den Organoiden freigesetzten Zellen zu ernten. Die geerntete Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen überführen und die Zellen bei 500 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur schleudern.
Nach dem Entfernen des Überstands werden die Zellen in einem Milliliter NK-1-Medium resuspendiert. Entfernen Sie die gesamte Beschichtungslösung aus der Vertiefung und waschen Sie jede Vertiefung einer 12-Well-Platte zweimal mit einem Milliliter PBS. Als nächstes teilen Sie die geernteten Zellen im Verhältnis 1:2 auf und übertragen die Zellsuspension auf eine beschichtete 12-Well-Platte.
Fügen Sie einen Milliliter NK-1-Medium hinzu, so dass jede Vertiefung 1,5 Milliliter Medium enthält. Um das Medium zu wechseln, lassen Sie die Zellen für ein bis zwei Minuten auf den Boden sinken. Saugen Sie dann vorsichtig 750 Mikroliter Medium ab und schleudern Sie es wie zuvor gezeigt nach unten.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das erhaltene Pellet in 750 Mikroliter NK-1-Medium durch fünf- bis sechsmaliges Pipettieren und übertragen Sie es in die ursprüngliche Vertiefung. In der vorliegenden Studie wurden die hEPSC-abgeleiteten Produkte am Endpunkt analysiert. Etwa 15% der Zellen, die aus dem 3D-Kultursystem aus zwei Chargen dissoziierten, die zu verschiedenen Zeitpunkten induziert wurden, waren CD3-negativ, CD56-positiv und 16% der Zellen waren CD45-positiv, CD-56-positiv, was mit den Prozentsätzen von CD3-negativen, CD56-positiven Zellen übereinstimmt, die in früheren Studien beobachtet wurden.
Die Prozentsätze von CD3-negativen, CD56-positiven Zellen in den Zellen, die aus dem 2D-Kultursystem geerntet wurden, lagen zwischen 30 und 6%Die hEPSC-abgeleiteten Produkte während der Tag-18-Kultur aus dem 2D-System zeigten nach zweistündiger Antikörperstimulation eine Expression von ektopischem CD56 und CD107a in 12% der Zellen, und etwa 28% der geernteten Zellen waren CD94-positiv. CD159a-positiv. Die In-vitro-Differenzierungspräparate wurden auf Zytotoxizität gegen humane Erythroleukämie-Zellen K562 getestet. Bei dreistündiger Co-Kultivierung mit Tumortargets zeigen die differenzierten Produkte eine leichte Zytotoxizität im Vergleich zu einer Interleukin-2-unabhängigen permanenten Zelllinie NK92mi-Zellen.
Mit dieser Methode können Zellen wie T-Zellen, B-Zellen und Erythrozyten erzeugt werden.
