중요성에 대해 말하자면, 확장 가능한 소스에서 NK 세포를 생성하는 것은 암 면역 요법과 같은 응용 분야에 매우 중요합니다. 이 기술의 장점은 일반 IP 세포 대신 더 넓은 분화 능력을 가진 확장 된 잠재적 줄기 세포를 사용할 수 있다는 것입니다. hEPSC의 사전 분화를 위해, 세포가 유지되었던 hEPSC 배지를 제거하고 1밀리리터의 DFK 배지를 첨가한다.
섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 2-3 일 동안 배양하십시오. 배아체의 형성을 확인하기 위해, 소비 된 DFK 배지를 제거한 후, 1 밀리리터의 PBS로 세포를 한 번 세척한다. 500 마이크로 리터의 0.05 % 트립신을 추가하고 형태에 따라 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 3-7 분 동안 플레이트를 배양합니다.
트립신이 제거되면, 2 밀리리터의 DFK 배지를 세포를 수확한다. 실온에서 3 분 동안 300G에서 세포를 스핀 다운합니다. 상청액을 제거한 후 DFK 배지 1밀리리터와 Y-27632 마이크로리터 1마이크로리터를 추가하고 플릭으로 세포를 재현탁합니다.
혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 세포 현탁액을 DFK 배지와 Y-27632로 희석하여 배지 25 마이크로 리터 당 4, 000 세포를 얻습니다. 10cm 페트리 접시의 뚜껑에 30-40방울의 세포 현탁액을 놓고 물방울의 증발을 방지하기 위해 PBS를 아래쪽 접시에 붓습니다. 접시를 덮기 위해 뚜껑을 부드럽게 뒤집고 섭씨 37도, 5%이산화탄소에서 3일 동안 배양합니다.
액적으로부터 배아체를 수집하기 위해, PBS를 함유하는 1-밀리리터 피펫을 사용하여, 액적 내로 약간의 PBS를 펌핑하고, 배아체를 포함하는 배지를 흡인한다. 그런 다음이 배아체를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 1 분 동안 100G에서 회전시킵니다. 상청액을 제거한 후 배지 A 1 밀리리터를 넣고 수집 된 배아 체를 비 부착 성 24 웰 플레이트로 옮기고 0 일로 간주합니다.
배아체의 중배엽 패턴을 수행하려면 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 3일 동안 배양합니다. 둘째 날에는 500 마이크로 리터의 사용 된 배지 A를 동일한 부피의 새 배지 A로 교체하십시오. 배아체의 혈액 내피 사양을 수행하려면 웰에서 700 마이크로 리터의 배지 A를 제거하고 동일한 부피의 배지 B를 7 일 동안 배양하여 2 일마다 반 배지를 교체합니다.
패턴화된 배아체를 공기/액체 계면으로 옮기려면 플레이트를 약간 기울여 배아체가 바닥에 응집되도록 하고 1밀리리터 피펫을 사용하여 배지 B를 최대한 제거합니다. 이제 남은 배지를 흡인하여 피펫으로 배아체를 집어 들고 24웰 플레이트의 트랜스웰로 옮기고, 림프구 전구체 확장을 수행하기 위해 트랜스웰의 하부 구획에 NK-1배지 500마이크로리터를 첨가하고 14일 동안 배양한 후 격일로 배지 교체를 수행한다. 플레이트를 코팅하려면 PBS로 코팅 재료를 희석하고 12웰 플레이트의 각 웰에 희석된 코팅 용액 1밀리리터를 추가하고 플레이트의 개구부를 포장 필름으로 덮습니다.
접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 200 마이크로 리터의 PBS를 트랜스 웰에 넣고 천천히 위아래로 5-6 회 피펫하여 오가노이드에서 방출 된 세포를 수확합니다. 수확된 세포 현탁액을 2밀리리터 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 500G에서 세포를 스핀다운합니다.
상청액을 제거한 후, 세포를 NK-1 배지 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 웰로부터 모든 코팅 용액을 제거하고 12-웰 플레이트의 각 웰을 1 밀리리터의 PBS로 2회 세척한다. 다음으로, 수확된 세포를 1:2의 비율로 분할하고 세포 현탁액을 코팅된 12웰 플레이트에 옮깁니다.
각 웰에 1.5 밀리리터의 배지가 있도록 1 밀리리터의 NK-1 배지를 추가합니다. 배지를 교체하려면 셀을 1-2 분 동안 바닥으로 가라 앉히십시오. 그런 다음 750 마이크로 리터의 배지를 조심스럽게 흡인하고 앞에서 보여준대로 스핀 다운합니다.
상층액을 버린 후, 수득한 펠렛을 750 마이크로리터의 NK-1 배지에 5-6회 피펫팅하여 재현탁시키고 원래의 웰로 옮긴다. 본 연구에서는 종말점에서 hEPSC 유래 생성물을 분석하였다. 서로 다른 시점에 유도된 두 배치의 3D 배양 시스템에서 해리된 세포의 약 15%는 CD3 음성, CD56 양성이었고, 세포의 16%는 CD45 양성, CD-56 양성으로 이전 시험에서 관찰된 CD3 음성, CD56 양성 세포의 비율과 일치합니다.
2D 배양 시스템에서 수확 한 세포에서 CD3 음성, CD56 양성 세포의 비율은 30에서 6 % 범위2D 시스템에서 18 일째 배양 중 hEPSC 유래 제품은 항체 자극 2 시간 후 세포의 12 %에서 이소성 CD56 및 CD107a의 발현을 보여 주었고, 수확 된 세포의 약 28 %는 CD94 양성이었다. CD159a 양성. 시험관내 분화 생성물을 인간 적혈구 세포 K562에 대한 세포독성에 대해 시험하였다. 3 시간 동안 종양 표적과 공동 배양했을 때, 분화 된 생성물은 인터루킨 2- 독립적 인 영구 세포주 NK92mi 세포에 비해 경미한 세포 독성을 나타낸다.
이 방법에 따라 T 세포, B 세포 및 적혈구와 같은 세포를 생성 할 수 있습니다.
