Öneminden bahsetmişken, genişletilebilir bir kaynaktan NK hücreleri üretmek, kanser immünoterapisi gibi uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Bu teknolojinin avantajı, normal IP hücreleri yerine daha geniş farklılaşma kapasitesine sahip genişletilmiş potansiyel kök hücrelerin kullanılabilmesidir. hEPSC'lerin önceden farklılaşması için, hücrelerin muhafaza edildiği hEPSC ortamını çıkarın ve bir mililitre DFK ortamı ekleyin.
İki ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Embriyoid cisimlerin oluşumunu kontrol etmek için, harcanan DFK ortamını çıkardıktan sonra, hücreleri bir kez bir mililitre PBS ile yıkayın. 500 mikrolitre% 0.05 tripsin ekleyin ve morfolojiye bağlı olarak plakayı üç ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Tripsin çıkarıldıktan sonra ve hücreleri hasat etmek için iki mililitre DFK ortamı. Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, bir mililitre DFK ortamı ve bir mikrolitre Y-27632 ekleyin ve hücreleri hafifçe vurarak yeniden askıya alın.
Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 25 mikrolitre ortam başına 4.000 hücre elde etmek için hücre süspansiyonunu DFK ortamı ve Y-27632 ile seyreltin. 10 santimetrelik bir Petri kabının kapağına 30 ila 40 damla hücre süspansiyonu yerleştirin ve damlacıkların buharlaşmasını önlemek için alt kaba bir miktar PBS dökün. Çanağı örtmek için kapağı yavaşça ters çevirin ve üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Embriyoid cisimleri damlacıktan toplamak için, PBS içeren bir mililitrelik pipet kullanarak, damlacığa biraz PBS pompalayın ve embriyoid cisimleri de dahil olmak üzere ortamı aspire edin. Daha sonra, bu embriyoid cisimleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca 100 G'de döndürün. Süpernatanı çıkardıktan sonra, bir mililitre orta A.Toplanan embriyoid cisimleri yapışkan olmayan 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın ve sıfır günü düşünün.
Embriyoid cisimlerin mezoderm desenlemesini yapmak için, plakayı üç gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci günde, 500 mikrolitre harcanmış orta A'yı aynı hacimdeki taze orta A ile değiştirin. Embriyoid cisminin hematoendotelyal spesifikasyonunu gerçekleştirmek için, kuyudan 700 mikrolitre orta A çıkarın ve yedi gün boyunca aynı miktarda orta B.Kültür ekleyin, yarım medyayı her iki günde bir değiştirin.
Desenli embriyoid cisimleri bir hava/sıvı arayüzüne aktarmak için, plakayı hafifçe eğin, böylece embriyoid cisimleri altta toplanır ve bir mililitrelik bir pipet kullanarak, mümkün olduğunca fazla B ortamını çıkarın. Şimdi kalan ortamı aspire ederek embriyo gövdelerini bir pipetle alın ve 24 delikli bir plakadaki bir trans-kuyucuğuna aktarın, Lenfoid progenitör genişlemesi gerçekleştirmek için, trans-kuyucuğun alt bölmesine 500 mikrolitre NK-1 ortamı ekleyin, 14 gün boyunca kültür ve her gün orta bir değişiklik yapın. Plakayı kaplamak için, kaplama malzemesini PBS cinsinden seyreltin, 12 delikli bir plakanın her bir oluğuna bir mililitre seyreltilmiş kaplama çözeltisi ekleyin ve plakanın açıklığını sarma filmi ile örtün.
Plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Trans kuyucuğuna 200 mikrolitre PBS ekleyin ve organoidlerden salınan hücreleri toplamak için yaklaşık beş ila altı kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Toplanan hücre süspansiyonunu iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 G'de döndürün.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri bir mililitre NK-1 ortamında yeniden askıya alın. Tüm kaplama çözeltisini kuyudan çıkarın ve 12 delikli bir plakanın her bir kuyusunu bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hasat edilen hücreleri 1: 2 oranında bölün ve hücre süspansiyonunu kaplanmış 12 delikli bir plakaya aktarın.
Bir mililitre NK-1 ortamı ekleyin, böylece her kuyucukta 1,5 mililitre ortam bulunur. Ortamı değiştirmek için, hücrelerin bir ila iki dakika boyunca dibe batmasına izin verin. Ardından, 750 mikrolitre ortamı dikkatlice aspire edin ve daha önce gösterildiği gibi aşağı doğru döndürün.
Süpernatanı attıktan sonra, elde edilen peleti 750 mikrolitre NK-1 ortamında beş ila altı kez pipetleyerek yeniden askıya alın ve orijinal kuyucuğa aktarın. Bu çalışmada son noktada bulunan hEPSC türevi ürünler analiz edilmiştir. Farklı zaman noktalarında indüklenen iki partiden 3D kültür sisteminden ayrılan hücrelerin yaklaşık% 15'i CD3-negatif, CD56-pozitif idi ve hücrelerin% 16'sı CD45-pozitif, CD-56-pozitifti, bu da daha önceki çalışmalarda görülen CD3-negatif, CD56-pozitif hücrelerin yüzdeleriyle uyumludur.
2D kültür sisteminden toplanan hücrelerdeki CD3-negatif, CD56-pozitif hücrelerin yüzdeleri% 30 ila% 6 arasında değişmiştir 2D sistemden 18 kültür sırasında hEPSC türevi ürünler, iki saatlik antikor stimülasyonundan sonra hücrelerin% 12'sinde hem ektopik CD56 hem de CD107a ekspresyonu gösterdi ve hasat edilen hücrelerin yaklaşık% 28'i CD94-pozitifti, CD159a-pozitif. İn vitro farklılaşma ürünleri, insan eritrolösemi hücreleri K562'ye karşı sitotoksisite açısından test edildi. Üç saat boyunca tümör hedefleriyle birlikte kültürlendiğinde, farklılaşmış ürünler, interlökin-2-bağımsız kalıcı hücre hattı NK92mi hücrelerine kıyasla hafif sitotoksisite gösterir.
Bu yöntemi takiben, T hücreleri, B hücreleri ve eritrositler gibi hücreler üretilebilir.
